组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
环磷酸腺苷（cAMP，cyclic AMP）；样品基质为活RAW264.7巨噬样细胞胞质及吞噬体周围区域，细胞处于Ringers buffer中并吞噬IgG调理羊红细胞（sRBC）。
检测原理
该传感器为FRET型荧光cAMP生物传感器。mCFP-mCit Epac-camps中，Epac1-camps作为cAMP识别域，mCFP为供体，mCit为受体。胞内cAMP结合Epac1-camps后引起构象变化，改变mCFP与mCit间距，使FRET效率下降。显微镜分别采集供体ID、受体IA和FRET IF图像，经背景、光照不均和光漂白校正后计算校正FRET效率EA。EA下降幅度反映局部cAMP升高；吞噬体附近EA下降表示cAMP短暂爆发，颗粒内化后EA恢复，提示cAMP回到基线。该方法无酶促放大，依赖FRET比色校正与区域分析提高时空分辨。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该FRET探针在活细胞中表现出对cAMP的特异性：C4对照在吞噬过程中EA无变化，RI比值亦无显著变化，排除选择性光漂白；将YFP突变为Citrine（Q69M）降低胞质pH波动造成的伪影。探针每30秒成像，可覆盖约7–8 min吞噬过程。总细胞cAMP在吞噬前后无显著差异，但吞噬体附近R1/R2区域EA显著下降，提示cAMP短暂升高，约1 min后出现并持续数分钟，内化后恢复基线。EdTx较forskolin使cAMP升高7.5倍，EA分别下降约10%和5%；C4与Epac-camps的EA分别为0.448±0.004和0.254±0.002。作者认为该方法可解析cAMP在吞噬体形成中的时空作用。
传感器的构成
- 基底/成像基底：No. 1.5 圆形盖玻片（25 mm），承载RAW264.7细胞并用于倒置显微镜成像
- 细胞样品层：RAW264.7巨噬样细胞，在Ringers buffer中培养并吞噬IgG调理羊红细胞（sRBC）
- 传感蛋白换能器：mCFP-mCit Epac-camps（Epac1-camps融合mCFP与Citrine/YFP-Q69M），cAMP结合引起构象变化
- 识别元件：Epac1-camps的cAMP结合域，特异性结合胞内cAMP
- 信号标记/荧光对：供体mCFP（ex 430±12.5 nm/em 470±15 nm）与受体mCit（ex 500±10 nm/em 535±15 nm），通过FRET效率报告cAMP
- 对照/校准元件：C4（mCFP-mCit共价连接）与G4（mCFP-YFP），用于FRET校准、光漂白和pH对照
中文摘要
环磷酸腺苷（cAMP）调控多种生物学过程与细胞功能，其胞内空间梯度日益受到重视。既往研究表明，巨噬细胞吞噬过程中会产生cAMP，且cAMP水平升高会抑制促炎介质生成、吞噬和杀菌等宿主防御功能，但吞噬性巨噬细胞中cAMP生成的空间与动力学特征尚不清楚。本研究采用基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器，在活巨噬细胞中测量cAMP生成。结果显示，静息细胞与正在吞噬IgG调理颗粒的细胞之间，整体胞内cAMP水平无差异；但生物传感器分析发现，FRET信号快速下降，对应于正在形成的吞噬体附近出现短暂的cAMP生成爆发。颗粒内化后，cAMP水平恢复至基线。这些结果表明，吞噬体形成伴随局部cAMP升高，为更完整理解cAMP如何调控巨噬细胞宿主防御功能提供了框架。
英文摘要
Cyclic AMP (cAMP) regulates many biological processes and cellular functions. The importance of spatially localized intracellular gradients of cAMP is increasingly appreciated. Previous work in macrophages has shown that cAMP is produced during phagocytosis and that elevated cAMP levels suppress host defense functions, including generation of proinflammatory mediators, phagocytosis and killing. However, the spatial and kinetic characteristics of cAMP generation in phagocytosing macrophages have yet to be examined. Using a Förster resonance energy transfer (FRET)-based cAMP biosensor, we measured the generation of cAMP in live macrophages. We detected no difference in bulk intracellular cAMP levels between resting cells and cells actively phagocytosing IgG-opsonized particles. However, analysis with the biosensor revealed a rapid decrease in FRET signal corresponding to a transient burst of cAMP production localized to the forming phagosome. cAMP levels returned to baseline after the particle was internalized. These studies indicate that localized increases in cAMP accompany phagosome formation and provide a framework for a more complete understanding of how cAMP regulates macrophage host defense functions.