组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
生物可利用铵（bioavailable ammonium, NH4+/NH3）；样品基质：土壤水超滤液（soil-water supernatant）、土壤悬浮液（soil slurry，含颗粒结合铵）、液体铵标准溶液
检测原理
该传感器以完整 Nitrosomonas europaea (pHLUX20) 细胞为识别与换能单元。样品中的 NH4+/NH3 被氨氧化菌摄取并进入氨氧化代谢，luxAB 荧光素酶活性与氨氧化活性紧密偶联，使细胞代谢状态转化为生物发光信号。检测前加入 n-decanal 作为荧光素酶底物，在氧存在下催化发光反应；发光强度随可被细胞利用的铵浓度升高而增强，在低浓度范围内呈线性响应。对土壤悬浮液，采用未加铵样品与 33 mM NH4+ 加标样品计算 RLU%max，以比值归一化校正土壤颗粒对光的遮蔽。通过控制 pH、温度、氧和10 min短孵育，实现快速定量生物可利用铵。
检测灵敏度
LOD: ∼20 µM（quantification limit in liquid samples）；22 µM（10 min, 3.0 × 10^8 cells mL-1, pH 7.8）；线性范围: up to 400 µM（linear response range）；up to 1000 µM NH4+（linear for concentrations）；10 min 定量上限: 100 µM（3.0 × 10^8 cells mL-1, pH 7.8）
效应效果
该传感器对尿素（0.01–100 mM）和20种氨基酸（100 µM）无响应，显示对铵的选择性。标准曲线可重复，pH 7.5、7.8、8.0下标准误差平均为1.5%、2.5%、1.4%。土壤水超滤液中生物传感器与化学法呈近1:1相关；固相接触法经 RLU%max 归一化可校正土壤颗粒遮光，并在未施肥土壤中定量生物可利用铵。好氧与厌氧土壤中生物可利用铵/水提取铵平均比为2.8和13.0，/KCl交换铵为0.77和1.13；颗粒结合铵至少贡献74%和93%。作者认为其适用于土壤肥力、稻田、沉积物和硝化污泥等环境监测。
传感器的构成
- 传感细胞层：Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (pHLUX20) 报告菌株，光自养氨氧化菌，负责摄取/氧化铵并产生生物发光
- 报告基因层：luxAB 基因（来自 Vibrio harveyi），编码荧光素酶，将氨氧化代谢偶联为发光信号
- 发光底物层：n-decanal（正癸醛）溶液，作为荧光素酶底物，在测量前加入以产生/增强生物发光
- 反应介质层：autotrophic growth medium (AG medium, pH 7.5/7.8/8.0)，含 kanamycin (25 mg/L) 用于培养，无铵 AG medium 用于重悬传感细胞
- 样品接触层：土壤水超滤液（soil-water supernatant）或土壤悬浮液（soil slurry），提供溶解态及颗粒结合态铵
- 读出装置层：luminometer（BioOrbit 1253），测量生物发光 RLU
- 归一化对照层：未加铵样品与 33 mM NH4+ 加标样品，计算 RLU%max 以校正土壤颗粒遮光
中文摘要
了解土壤中严格意义生物可利用铵（即可被细胞立即吸收的铵）对理解微生物养分吸收过程及植物生产至关重要。本文报道了一种基于光自养氨氧化菌 Nitrosomonas europaea 的新型铵生物传感器方法。该菌株携带来自 Vibrio harveyi 的 luxAB 传感质粒，其生物发光（荧光素酶活性）与氨氧化活性紧密偶联。在液体样品中，生物发光检测可在10 min内完成，定量限约为20 µM，线性响应范围可达400 µM。在多种样品和检测条件下，生物传感器结果与传统化学定量方法高度一致。作者进一步将该传感器用于固相接触检测，使传感细胞直接与土壤颗粒结合态（交换态加固定态）铵相互作用。该方法成功定量了未施肥土壤中的生物可利用铵，并显示厌氧土壤中生物可利用铵与水分或2 M KCl交换态铵的比值显著高于好氧土壤。颗粒结合铵至少贡献好氧和厌氧土壤总生物可利用铵池的74%和93%。该 N. europaea 生物传感器有望广泛用于环境监测生物可利用铵及其相关过程。
英文摘要
Knowledge on bioavailable ammonium sensu strictu (i.e., immediately available for cellular uptake) in soil is required to understand nutrient uptake processes in microorganisms and thus of vital importance for plant production. We here present a novel ammonium biosensor approach based on the lithoautotrophic ammonia-oxidizing bacterium Nitrosomonas europaea transformed with a luxAB sensor plasmid. Bioluminescence-based ammonium detection was achieved within 10 min with a quantification limit in liquid samples of ∼20 μM and a linear response range up to 400 μM. Biosensor and conventional chemical quantification of ammonium in soil solutions agreed well across a range of sample and assay conditions. The biosensor was subsequently applied for a solid phase-contact assay allowing for direct interaction of biosensor cells with soil particle-associated (i.e., exchangeable plus fixed) ammonium. The assay successfully quantified bioavailable ammonium even in unfertilized soil and demonstrated markedly higher ratios of bioavailable ammonium to water- or 2 M KCl-exchangeable ammonium in anoxic soil than in corresponding oxic soil. Particle-associated ammonium contributed by at least 74% and 93% of the total bioavailable pool in oxic and anoxic soil, respectively. The N. europaea biosensor should have broad relevance for environmental monitoring of bioavailable ammonium and processes depending on ammonium bioavailability.