组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
AF4-MLL融合蛋白FYRN/FYRC异二聚化相互作用（AF4-MLL heterodimerization / FYRN-FYRC protein-protein interaction）；样品基质：HEK293T或HeLa活细胞及细胞裂解液
检测原理
该生物传感器基于活细胞内蛋白相互作用诱导的荧光转位。bait质粒表达SV40 NLS-GFP-GST-FYRC-HIV-1 Rev NES融合蛋白，因NES较强主要在胞质与核间穿梭；prey质粒表达HIV-1 Rev M10BL-BFP-FYRN融合蛋白，锚定于核仁。当FYRN与FYRC发生特异性结合时，bait被prey带入核仁，GFP与BFP在核仁共定位，荧光显微镜下出现阳性信号；无相互作用时GFP主要位于胞质。若AF4-MLL.N的FYRN域与MLL.C的FYRC域结合，则形成稳定复合物并抵抗SIAH1/2介导的蛋白酶体降解；表达GFP-B1或GFP-B3竞争结合FYRN后，异二聚化被阻断，AF4-MLL.N和MLL.C被SIAH1/2泛素化并经蛋白酶体降解，复合物相关蛋白WDR5/RBBP5结合减少。
检测灵敏度
未报告
效应效果
选择性方面，FYRC衍生肽B1、B2、B3分别与FYRN衍生肽A1、A2、A3在核仁共定位，交叉组合及mock对照均无共定位；短于30个氨基酸的单个亚片段不能稳定结合。功能验证中，GFP-B1和GFP-B3可结合Strep-tag标记的AF4-MLL.N，并几乎完全阻断MLL.C结合，同时降低SET域复合物组分WDR5和RBBP5的结合。未加MG132时，AF4-MLL.N和MLL.C水平显著下降；加入MG132后MLL.C可恢复，提示降解经蛋白酶体途径。作者认为FYRN/FYRC界面可被小肽或小分子靶向，为设计抑制性诱饵、破坏AF4-MLL癌蛋白并治疗t(4;11)白血病提供依据。
传感器的构成
- 细胞基底：HEK293T或HeLa活细胞，提供核质穿梭、核仁定位与蛋白相互作用检测的细胞环境。
- 表达载体：p3-NLS-GFP-GST-NES诱饵质粒与pc3-REV-BFP猎物质粒，分别表达bait和prey融合蛋白。
- 识别元件：MLL FYRN域（aa1991–2104）或FYRC域（aa3651–3752）及其亚片段A1–A3/B1–B3，介导FYRN-FYRC蛋白-蛋白相互作用。
- 信号标记物：GFP与BFP荧光蛋白，分别标记bait和prey融合蛋白，用于荧光显微镜读出。
- 定位信号：SV40 NLS与HIV-1 Rev NES使bait在核质间穿梭并偏胞质；HIV-1 Rev M10BL使prey锚定于核仁。
- 竞争抑制元件：GFP-B1或GFP-B3（FYRC衍生肽），结合FYRN并阻断AF4-MLL.N与MLL.C异二聚化。
- 读出系统：荧光显微镜观察核仁共定位；Strep-Tactin亲和纯化与免疫印迹验证复合物形成。
中文摘要
染色体易位t(4;11)(q21;q23)是混合系白血病（MLL）基因常见遗传异常，主要与儿童高危急性淋巴细胞白血病（ALL）相关。既往研究表明，移植表达AF4-MLL融合蛋白造血细胞的鼠可发生proB ALL。AF4-MLL癌蛋白经Taspase1介导水解后激活，其切割产物AF4-MLL.N与MLL.C通过FYRN和FYRC相互作用域形成异二聚体。该异二聚化进一步诱导约2 MDa高分子量蛋白复合物形成，并抵抗SIAH1/2介导的多聚泛素化。本研究旨在选择性阻断这一初始异二聚化步骤，从而阻止AF4-MLL多蛋白复合物的致癌激活。作者首先利用细菌双杂交系统实验界定最小相互作用界面，随后在哺乳动物细胞中采用生物传感器检测法验证。表达FYRC域或其较小片段可抑制异二聚体形成，阻断AF4-MLL多蛋白复合物组装，并导致AF4-MLL癌蛋白被降解。因此，AF4-MLL蛋白原则上可被特异性靶向，相关结构知识可用于设计抑制性诱饵以破坏AF4-MLL癌蛋白。
英文摘要
The chromosomal translocation t(4;11)(q21;q23) is a frequent genetic aberration of the mixed lineage leukemia (MLL) gene, predominantly associated with high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL) in pediatric patients. Previous studies demonstrated that mice transplanted with hematopoietic cells expressing the AF4-MLL fusion protein develop proB ALL. The AF4-MLL oncoprotein becomes activated by Taspase1-mediated hydrolysis, which subsequently leads to a heterodimer of the cleavage products AF4-MLL·N and MLL·C. This protein-protein interaction is due to the FYRN and FYRC interaction domains present in both protein fragments. Heterodimerization subsequently induces high-molecular-weight protein complex formation that is protected against SIAH1/2-mediated polyubiquitinylation. Here, we attempted to selectively block this initial heterodimerization step, aiming to prevent the oncogenic activation of the AF4-MLL multiprotein complex. The minimal interaction interface was experimentally defined first in a bacterial two-hybrid system, and then in mammalian cells by using a biosensor assay. Expression of the FYRC domain, or smaller portions thereof, resulted in the inhibition of heterodimer formation, and blocked AF4-MLL multiprotein complex formation with subsequent destruction of the AF4-MLL oncoprotein. Thus, it is in principle possible to specifically target the AF4-MLL protein. This knowledge can now be exploited to design inhibitory decoys in order to destroy the AF4-MLL oncoprotein.