组成图示
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传感器类型
其他（压电悬臂梁生物传感器）
检测对象
活大肠杆菌JM101（E. coli JM101，活细胞/细胞活性），样品基质：PBS细胞悬液/流动池PBS缓冲液
检测原理
传感器表面聚-L-赖氨酸非特异性固定活大肠杆菌。BCECF-AM可扩散进入活细胞，被胞内非特异性酯酶水解为BCECF；BCECF在胞质pH下带4–5个负电荷，因而滞留并积累于活细胞内，使单个活细胞质量增加约0.16 fg。表面活细胞越多，总质量增加越大，压电激励毫米级悬臂梁的共振频率随之下降。频率变化由阻抗分析仪实时读出，并与表面细胞浓度呈对数线性关系。该过程利用活细胞特有的酯酶活性和多电荷染料积累实现活/死细胞区分，无额外核酸或酶催化沉积放大。
检测灵敏度
LOD: ∼2 000 viable E. coli cells (<1 h)；线性范围: 1 000-4 000 cells/mm2；灵敏度斜率: y = 426.43 ln(x) - 3003.2；质量灵敏度: ∼1.5 fg/Hz；R^2 = 0.9115
效应效果
无细胞对照无响应；死细胞（3490±470 cells/mm2）仅62±4 Hz，活细胞（3960±370 cells/mm2）为864±15 Hz，显示活/死选择性。稳态后PBS冲洗20 min无变化，提示BCECF泄漏小。BCECF处理后细胞仍可生长，AC肉汤引起约600 Hz密度响应和约2100 Hz生长响应，比生长速率2.1 h−1。传感器一致性较好，空气-水频率偏移70.50±4.50 kHz（m=30），灵敏度变化约7%。荧光随细胞浓度升高，与频率响应一致。作者认为可在1 h内检测约2000个活细胞，适用于活病原菌检测与环境毒性监测。
传感器的构成
- 基底/换能器：石英层与PZT压电层复合悬臂梁，提供压电激励和共振频率质量传感
- 绝缘层：Parylene-C（10 μm，化学气相沉积），用于液体环境绝缘
- 传感界面金属层：金（Au，100 nm，溅射），提供细胞附着表面
- 固定/识别层：聚-L-赖氨酸（PLL，0.1% w/v），非特异性固定大肠杆菌
- 生物识别对象：活大肠杆菌JM101（E. coli JM101），作为替代病原菌并被固定于表面
- 信号探针：BCECF-AM（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester），进入活细胞后水解为BCECF并积累
- 信号读出：阻抗分析仪（HP4192A）与LabVIEW程序，实时采集共振频率和阻抗
中文摘要
活病原菌检测对食品安全和人类健康具有重要意义，但抗体法通常需要培养步骤，导致结果时间较长。本研究采用质量变化敏感的压电悬臂梁生物传感器，并结合仅进入活细胞并积累的探针BCECF-AM，通过活细胞内酯酶将BCECF-AM水解为带负电荷的BCECF并滞留于胞内，引起细胞质量增加，使悬臂梁共振频率下降，从而快速判断细胞活性。将不同浓度活大肠杆菌JM101固定于聚-L-赖氨酸修饰的传感器表面，在流动体系中注入100 μL 60 μM BCECF-AM。当传感器表面细胞浓度从1090±580 cells/mm2增至3960±370 cells/mm2时，频率下降增大；在1000–4000 cells/mm2范围内，表面细胞浓度与频率响应呈对数线性关系，可在1 h内快速检测约2000个活E. coli。该策略有望缩短活病原菌检测时间。
英文摘要
Detection of viable pathogenic bacteria has widespread application in food safety and human health. Antibody-based methods require a growth step which limits time-to-results performance. In this study, we use a mass-change sensitive cantilever biosensor and a probe, 2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM), that accumulates only in live cells inducing a mass-change response to determine the cell viability in a short time. A poly-L-lysine coated sensor immobilized with live Escherichia coli JM101 (a surrogate for a pathogenic target) at various concentrations was exposed to BCECF-AM in a flow arrangement. A larger resonant frequency decrease in response to 100 μL of 60 μM BCECF-AM was observed when the sensor surface cell concentration was increased from 1 090 ± 580 to 3 960 ± 370 cells/mm(2) (n = 5). A log-linear relationship between the sensor surface cell concentration and frequency response was obtained in the range of 1 000-4 000 cells/mm(2) and as low as ∼2 000 viable E. coli cells were rapidly detected (<1 h).