组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
磷乙酸（phosphonoacetate, PA）；样品基质：LB 液体或琼脂固体培养基（拟用于环境微生物/环境样品筛选）
检测原理
磷乙酸（PA）进入宿主菌后，与 LysR 型转录调控子 PhnR 结合，使 PhnR 发生构象变化并激活 PphnA/PphnR 启动子。该启动子驱动下游 gfp 报告基因转录和翻译，产生绿色荧光蛋白（GFP）。GFP 荧光强度随 PA 浓度升高而增加，在约 500 mM PA 时趋于饱和。检测时以 485 nm 激发、535 nm 发射测量荧光，并用 OD600 归一化得到特异性荧光单位（SFU），以含诱导剂样品与未诱导对照的 SFU 比值（SFUx/SFUo）表示诱导水平。该体系不依赖电极或化学标记，而是利用全细胞基因表达实现信号放大。
检测灵敏度
LOD（最低可检测浓度）: 0.5 mM PA；现有非生物方法检测下限: 50 mM；PA 响应饱和: 约 500 mM；P. putida KT2440 最低可检测浓度: 10 mM；类似物阈值: 50 mM phosphonoacetaldehyde、500 mM arsonoacetate（摘要）/0.5–50 mM（结果）
效应效果
该传感器对 PA 选择性较高：17 种有机膦酸和 5 种类似物中仅磷乙醛、砷乙酸诱导 GFP，且灵敏度显著降低；PA 响应约 500 mM 饱和。与现有非生物方法（下限 50 mM）相比，E. coli DH5a(pPANT3) 可检测 0.5 mM PA，灵敏度提高约 100 倍。P. putida KT2440(pPANT3) 需 ≥10 mM，但 100 mM PA 下 2 h 可检测，20 h 峰值比 E. coli 高 2.0–2.5 倍。实验为三次重复并报告标准差。作者认为其可用于筛选环境产 PA 微生物，并可通过琼脂覆盖层固定实现高通量筛选。
传感器的构成
- 宿主细胞：E. coli DH5a-T1R（或 P. putida KT2440），作为全细胞传感平台，提供代谢与基因表达系统
- 传感质粒：pPANT3（pPROBE-NT::phnR–ΔphnA–gfp），携带 PA 响应调控区、报告基因与选择标记
- 识别元件：LysR 型转录调控子 PhnR（来自 P. fluorescens 23F），结合 PA 并激活下游启动子
- 响应启动子：PphnR/PphnA 启动子区及 phnA 前 29 nt（ΔphnA），介导 PA 诱导的转录
- 报告基因：gfp（绿色荧光蛋白基因），表达 GFP 产生荧光信号
- 终止子：T1/T4 rrnB1 转录终止子，防止克隆启动子读通转录
- 选择标记：npt(km) 卡那霉素抗性基因，用于 pPANT3 质粒筛选
中文摘要
磷乙酸（phosphonoacetate, PA）是含稳定碳-磷键的有机膦酸，其环境分布广泛，但天然来源尚未明确。为寻找其生物来源，作者基于荧光假单胞菌 23F 中控制磷乙酸降解操纵子表达的 LysR 型转录调控子 PhnR，构建了全细胞 PA 生物传感器。将 phnR 基因及其结构基因启动子区克隆至广宿主启动子探针载体 pPROBE-NT，形成 phnR–ΔphnA–gfp 转录融合质粒 pPANT3。携带 pPANT3 的大肠杆菌 DH5a 在 0.5 mM PA 下即可产生 PA 依赖的绿色荧光蛋白（GFP）荧光，灵敏度较现有非生物分析方法低约 100 倍；在 Pseudomonas putida KT2440 中灵敏度较低但响应更快。对多种膦酸及类似物的测试显示，仅磷乙醛和砷乙酸能诱导荧光，但灵敏度显著降低。该传感器可用于筛选环境中产生 PA 的微生物。
英文摘要
The phnA gene that encodes the carbon-phosphorus bond cleavage enzyme phosphonoacetate hydrolase is widely distributed in the environment, suggesting that its phosphonate substrate may play a significant role in biogeochemical phosphorus cycling. Surprisingly, however, no biogenic origin for phosphonoacetate has yet been established. To facilitate the search for its natural source we have constructed a whole-cell phosphonoacetate biosensor. The gene encoding the LysR-type transcriptional activator PhnR, which controls expression of the phosphonoacetate degradative operon in Pseudomonas fluorescens 23F, was inserted in the broad-host-range promoter probe vector pPROBE-NT, together with the promoter region of the structural genes. Cells of Escherichia coli DH5α that contained the resultant construct, pPANT3, exhibited phosphonoacetate-dependent green fluorescent protein fluorescence in response to threshold concentrations of as little as 0.5 µM phosphonoacetate, some 100 times lower than the detection limit of currently available non-biological analytical methods; the pPANT3 biosensor construct in Pseudomonas putida KT2440 was less sensitive, although with shorter response times. From a range of other phosphonates and phosphonoacetate analogues tested, only phosphonoacetaldehyde and arsonoacetate induced green fluorescent protein fluorescence in the E. coli DH5α (pPANT3) biosensor, although at much-reduced sensitivities (50 µM phosphonoacetaldehyde and 500 µM arsonoacetate).