组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
可卡因（cocaine）；样品基质：PBS 缓冲液（10 mM PBS, 0.3 M NaCl, pH 7.0）
检测原理
可卡因适配体固定于 Au NPs 修饰的磁性微球上，并与 cDNA 短链杂交。加入可卡因后，可卡因与适配体特异性结合，使 cDNA 从适配体上置换释放；磁性微球分离可去除未释放的固相 DNA，降低背景。释放的 cDNA 与 padlock probe 退火，经 T4 DNA 连接酶环化后，以 cDNA 为引物，在 phi29 DNA 聚合酶和 dNTPs 作用下进行 RCA，产生长链 ssDNA 产物。RCA 产物与分子信标杂交，使 FAM 与 DABCYL 分离，荧光开启。可卡因浓度越高，释放的 cDNA 越多，RCA 产物越多，荧光变化 ΔF 越大。
检测灵敏度
LOD: 4.8 × 10−10 M（0.48 nM）；线性范围: 1.0 × 10−9–5.0 × 10−8 M（对数线性）；灵敏度斜率: 63.585（ΔF = 63.585 log C + 214.177，C 以 10−6 M 计）；相关系数: 0.998
效应效果
该方法通过 RCA 放大和磁珠分离降低背景，实现高灵敏可卡因检测。荧光信号可检测范围为 0.5 nM–1.0 μM，对数线性范围为 1.0×10−9–5.0×10−8 M，相关系数 0.998，LOD 为 0.48 nM，优于 Yu 等报道的 1 nM 荧光适配体传感器。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示存在可卡因时产生高分子量 RCA 产物，Rsa I 酶切进一步确认产物身份。作者认为该策略可为多种蛋白质和小分子分析物提供基于 DNA 放大的高灵敏检测平台，也可将 DNA 固定于芯片表面用于高通量检测。原文未报告实际生物样品回收率、长期稳定性或 RSD。
传感器的构成
- 固相载体：巯基修饰磁性微球（thio-modified magnetic beads, 3–4 μm），用于捕获 DNA 并通过磁分离降低背景。
- 纳米材料修饰层：20 nm 金纳米颗粒（Au nanoparticles, Au NPs），修饰于磁珠表面，增大表面积并改善 DNA 固定。
- 识别元件：可卡因适配体（cocaine aptamer, 5′-TGA...-SH-3′），固定于 Au NPs，特异性结合可卡因。
- 短 DNA 探针：cDNA 短链（5′-GTC...-3′），与适配体杂交，被可卡因置换后作为 RCA 引物。
- 锁式探针：padlock probe（5′-P-CTG...-3′），与 cDNA 退火后由 T4 DNA 连接酶环化，作为 RCA 模板。
- 酶与底物：T4 DNA 连接酶、phi29 DNA 聚合酶、dNTPs 和 ATP，用于 padlock probe 环化及 RCA 扩增。
- 信号标记物：分子信标（molecular beacons, MBs, 5′-6-FAM...-DABCYL-3′），与 RCA 产物杂交后开启 FAM 荧光。
- 读出装置：荧光分光光度计（Hitachi F-4500），在激发 480 nm、发射 520 nm 下检测荧光。
中文摘要
本研究开发了一种基于适配体和滚动环扩增的新型高灵敏荧光生物传感器，用于可卡因的测定。将可卡因适配体固定于金纳米颗粒修饰的磁性微球上，并与短 DNA 链杂交。在可卡因存在时，由于可卡因与适配体特异性结合，短 DNA 链从适配体上被置换下来。随后，短 DNA 链经磁性微球分离，并作为引物启动滚动环扩增。滚动环扩增的末端产物通过与分子信标杂交产生荧光信号进行检测。借助滚动环扩增以及磁性微球分离降低背景信号，该新方法可检测低至 0.48 nM 的可卡因。与已报道的可卡因传感器相比，该方法表现出优异的灵敏度。该新策略可为多种蛋白质和小分子分析物提供基于 DNA 放大的高灵敏检测平台。
英文摘要
A novel and sensitive fluorescence biosensor based on aptamer and rolling circle amplification for the determination of cocaine was developed in the present work. Here cocaine aptamers immobilized onto Au nanoparticles modified magnetic beads hybridized with short DNA strand. In the presence of cocaine, the short DNA strand was displaced from aptamer owing to cocaine specially binding with aptamer. Next, the short DNA strand was separated by magnetic beads and used to originate rolling circle amplification as primer. The end products of rolling circle amplification were detected by fluorescence signal generation upon molecular beacons hybridizing with the end products of rolling circle amplification. With rolling circle amplification and the separation by magnetic beads reducing the background signal, the new strategy was suitable for the detection of as low as 0.48 nM cocaine. Compared with reported cocaine sensors, our method exhibited excellent sensitivity. Our new strategy may provide a platform for numerous proteins and low molecular weight analytes to highly sensitively detect by DNA amplification.