组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
过氧化氢（Hydrogen Peroxide, H2O2）；样品基质：哺乳动物细胞内不同区室（细胞质、线粒体基质、线粒体膜间隙、内质网、过氧化物酶体、细胞核）及细胞培养上清/细胞悬液加标。
检测原理
HyPer 是基于细菌 OxyR 氧化还原结构域与 cpYFP 融合构建的遗传编码荧光 H2O2 传感器。H2O2 进入目标区室后，氧化 OxyR 域 C199 形成次磺酸，并与 C208 形成二硫键；该氧化态改变 cpYFP 局部微环境，使其激发光谱在 420 nm 与 500 nm 处发生反向变化，通常 500/420 nm 激发荧光比率随 H2O2 浓度升高而增大。DTT 或细胞内硫醇-二硫键氧化还原酶可还原二硫键，使信号可逆。通过 NLS、PTS1、SelM 等靶向序列将 HyPer 定位到细胞核、过氧化物酶体、内质网、线粒体基质/膜间隙等区室，再用共聚焦显微镜、荧光分光光度计或微孔板读数仪读取比率荧光，从而反映局部 H2O2 水平。该方法无酶促放大，依赖比率荧光降低表达量影响。
检测灵敏度
灵敏度范围: 1–50 µM H2O2（细胞培养上清加标；原文 PDF 显示为 1–50 mM）；EC50: 7.97 ± 0.48 µM H2O2（原文 PDF 显示为 mM）
效应效果
HyPer 响应可逆且为比率荧光，受表达量影响较小。EC50 为 7.97±0.48 µM，比 roGFP 低约 25 倍，可检测低于 DCF 和 PG1 的 H2O2；后两者信号更大但不可逆。细胞核还原态最强，细胞质、线粒体、线粒体膜间隙和过氧化物酶体中 10–16% HyPer 氧化，内质网中 >70% 氧化。5 µM H2O2 刺激后最大响应在 2–4 min，恢复基线约 24.2±3.63–96.5±4.50 min。硒缺乏、GPx1 敲除或 SBP2 敲低未显著改变基础 H2O2；TR1 敲低细胞对 diamide 更敏感。PDGF、TNF-α 和鱼藤酮可诱导区室 H2O2 变化。
传感器的构成
- 表达基质：HEK293、NIH 3T3、TCMK1 等哺乳动物细胞，承载 HyPer 融合蛋白表达与区室定位
- 区室靶向序列：线粒体信号肽（人细胞色素 c 氧化酶亚基 VIII 双拷贝）、内质网靶向/滞留序列（小鼠 SelM）、过氧化物酶体 PTS1（SKL）、线粒体膜间隙序列（小鼠甘油磷酸脱氢酶 2 部分序列）、核定位信号（SV40 大 T 抗原 NLS 双拷贝），决定传感器亚细胞定位
- 识别/氧化还原元件：OxyR 氧化还原结构域（C199/C208），被 H2O2 氧化形成二硫键，实现可逆氧化还原响应
- 信号报告元件：cpYFP 黄色荧光蛋白域，其激发光谱随 OxyR 氧化态改变，在 420 nm 与 500 nm 处呈反向变化
- 表达载体：pEGFP-C3 质粒，用于克隆、连接和表达 HyPer 区室靶向融合蛋白
- 氧化/还原校准剂：H2O2 用于氧化、DTT 用于还原，建立完全氧化/还原状态并验证可逆性
中文摘要
过氧化氢（H2O2）的受控生成与清除在细胞氧化还原稳态和信号转导中起重要作用。本研究将遗传编码的 H2O2 荧光生物传感器 HyPer 靶向至哺乳动物细胞的不同区室，以考察这些过程。在 HEK293 细胞中表达的 HyPer 可感知低微摩尔水平的 H2O2，并对多种氧化还原扰动和信号事件产生可逆响应。当靶向至细胞核、细胞质、过氧化物酶体、线粒体膜间隙和线粒体基质时，HyPer 主要处于还原态，但各区室均检测到少量氧化态，提示哺乳动物细胞存在低水平过氧化氢张力；相比之下，内质网中的 HyPer 主要处于氧化态。利用该系统，作者表征了硫氧还蛋白还原酶缺陷、巯基氧化酶缺陷或硒缺乏等细胞体系中 H2O2 的调控，并监测了信号事件后不同区室 H2O2 的生成。结果表明，HyPer 可作为监测不同细胞区室 H2O2 生成的有价值工具，且一个区室生成的 H2O2 可转移至其他区室，为哺乳动物细胞中 H2O2 的区室化、动态变化和稳态调控提供了信息。
英文摘要
BACKGROUND: Controlled generation and removal of hydrogen peroxide play important roles in cellular redox homeostasis and signaling. We used a hydrogen peroxide biosensor HyPer, targeted to different compartments, to examine these processes in mammalian cells.
PRINCIPAL FINDINGS: Reversible responses were observed to various redox perturbations and signaling events. HyPer expressed in HEK 293 cells was found to sense low micromolar levels of hydrogen peroxide. When targeted to various cellular compartments, HyPer occurred in the reduced state in the nucleus, cytosol, peroxisomes, mitochondrial intermembrane space and mitochondrial matrix, but low levels of the oxidized form of the biosensor were also observed in each of these compartments, consistent with a low peroxide tone in mammalian cells. In contrast, HyPer was mostly oxidized in the endoplasmic reticulum. Using this system, we characterized control of hydrogen peroxide in various cell systems, such as cells deficient in thioredoxin reductase, sulfhydryl oxidases or subjected to selenium deficiency. Generation of hydrogen peroxide could also be monitored in various compartments following signaling events.
CONCLUSIONS: We found that HyPer can be used as a valuable tool to monitor hydrogen peroxide generated in different cellular compartments. The data also show that hydrogen peroxide generated in one compartment could translocate to other compartments. Our data provide information on compartmentalization, dynamics and homeostatic control of hydrogen peroxide in mammalian cells.