组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
磷脂酰肌醇(3,4)二磷酸 PI(3,4)P2、磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸 PIP3、CrkII 酪氨酸磷酸化（酪氨酸激酶活性）；样品基质：HeLa 细胞、MDCK 细胞及 Matrigel 三维培养 MDCK 囊泡
检测原理
该传感器为遗传编码 FRET 探针。TAPP1 PH 域结合膜上 PI(3,4)P2 后，构象改变使 mTFP1 与 sREACh 距离缩短，FRET 效率升高，mTFP1 荧光被非辐射猝灭；mKeima 作为大 Stokes 移内标，其荧光不受 FRET 影响，因此 Keima/mTFP1 比值随 PI(3,4)P2 浓度升高而增大。双光子 840 nm 激发下，sREACh 作为暗受体显著降低受体交叉激发，提高信噪比。对 PIP3 使用 GRP PH 域；对酪氨酸激酶活性，EGF 诱导 CrkII Tyr221 磷酸化后，SH2 域结合磷酸酪氨酸，同样拉近 mTFP1 与 sREACh，使 FRET 增加。该体系未采用 HCR/RCA 等酶促放大，而依靠内标比值和暗受体降低背景。
检测灵敏度
未报告
效应效果
在 HeLa 细胞中，EGF 刺激下 Pippi-PI(3,4)P2-KCS、-KGS 和 -KTS 在普通荧光显微镜下均产生约 4–5% 的 FRET 比值变化，而 R221L 突变体无响应；在双光子显微镜下 -KTS 响应显著高于 -KCS 和 -KGS。MDCK 囊泡中，野生型传感器侧膜 Keima/TFP 比值显著高于顶膜，配对 t 检验 P<0.01，突变体无此差异。PIP3 传感器在 EGF 刺激后 FRET 增加，R284C 突变体无显著变化。Picchu-KTS-X 在 EGF 刺激下 FRET 比值分别增加约 8%（普通荧光）和 10%（双光子），Y221F 突变体无响应。作者认为该策略可用于商业双光子显微镜，无需寿命成像模块，即可定量可视化膜脂和激酶活性。
传感器的构成
- 供体荧光蛋白：mTFP1（monomeric teal fluorescent protein），FRET 供体，双光子激发后向 sREACh 转移能量，其荧光猝灭反映结合事件
- 受体荧光蛋白：sREACh（super resonance energy accepting chromoprotein），暗 YFP 变体，FRET 受体，降低双光子交叉激发
- 识别元件：TAPP1 PH 域（pleckstrin homology domain），结合 PI(3,4)P2；GRP PH 域结合 PIP3；CrkII SH2 域识别磷酸化 Tyr221
- 定位元件：K-Ras C 端序列（K-Ras CT），将传感器靶向细胞质膜
- 内部对照蛋白：mKeima，大 Stokes 移荧光蛋白，作为传感器浓度内标，Keima/mTFP1 比值指示 FRET 效率
- 连接肽：(EAAAAR) 重复和 Gly-Gly linker，连接荧光蛋白与 PH/SH2 结构域，维持构象
- 表达载体：pCX4neo、pCAGGS 和 MuLV 逆转录病毒载体，用于瞬时或稳定表达融合蛋白
- 换能读出系统：双光子显微镜（TPE），840 nm Ti:Sapphire 激光激发，滤光片/二向色镜采集 mTFP1 与 mKeima 荧光
中文摘要
Pippi 是一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理的磷脂酰肌醇磷酸指示剂，由青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）对、夹在两者之间的 PH 结构域以及用于质膜定位的 K-Ras C 端序列组成。在双光子激发（TPE）显微镜下，用于激发 CFP 的条件会明显交叉激发 YFP，使初始 FRET 图像信噪比低，难以观察三维结构中的脂质分布。为解决该问题，作者将 Pippi-PI(3,4)P2 中的 YFP 和 CFP 分别替换为超共振能量接受色蛋白（sREACh）和单体蓝绿色荧光蛋白（mTFP1），并在 N 端融合内部对照蛋白 mKeima，以 Keima/mTFP1 比值指示 FRET 效率。表皮生长因子刺激可使 HeLa 细胞中 Keima/mTFP1 增加。该传感器成功显示 PI(3,4)P2 在三维培养的 MDCK 囊泡侧膜积累。此外，基于同一策略还开发了用于 PIP3 分布和酪氨酸激酶活性的 FRET 传感器，表明其可广泛用于双光子显微镜下信号转导事件的可视化。
英文摘要
Pippi (phosphatidyl inositol phosphate indicator) is a biosensor based on the principle of FRET (Förster resonance energy transfer), which consists of a pair of fluorescent proteins, CFP (cyan fluorescent protein) and YFP (yellow fluorescent protein), the PH domain sandwiched between them, and K-Ras C-terminal sequence for plasma membrane localization. Due to marked cross-excitation of YFP with the conditions used to excite CFP, initial FRET images obtained by TPE (two-photon excitation) microscopy suffered from low signal-to-noise ratio, hampering the observation of lipids in three-dimensional structures. To solve this problem, YFP and CFP in the original Pippi-PI(3,4)P(2) was replaced by sREACh (super resonance energy accepting chromoprotein) and mTFP1 (monomeric teal fluorescent protein), respectively. The biosensor was also fused with an internal control protein, mKeima, where Keima/mTFP1 indicates the FRET efficiency, and indeed epidermal growth factor stimulation increased Keima/mTFP1 in HeLa cells. This biosensor successfully showed PI(3,4)P(2) accumulation to the lateral membrane in the MDCK cyst cultured in a three-dimensional environment. Furthermore, other FRET-based biosensors for PIP(3) distribution and for tyrosine kinase activity were developed based on this method, suggesting its broad application for visualizing signal transduction events with TPE microscopy.