组成图示
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传感器类型
其他（多基质兼容 ELISA 免疫检测）
检测对象
人胎甲蛋白 A（human fetuin A, HFA/AHSG）；样品基质：标准品/PBS 缓冲液（未报告血清等实际样品基质）
检测原理
聚合物微孔板经 KOH 与 O2 等离子体处理后表面生成羟基/羰基，APTES 的烷氧基与之反应形成硅氧烷键，暴露氨基。EDC/SulfoNHS 活化抗体羧基后与表面氨基形成酰胺键，实现捕获抗体定向共价固定。样品中 HFA/AHSG 与捕获抗体特异性结合，随后生物素标记检测抗体结合抗原另一表位，SA-HRP 通过生物素-链霉亲和素高亲和结合引入 HRP。TMB 在 HRP 催化下被 H2O2 氧化生成蓝色产物，经 H2SO4 终止后在 450 nm 产生吸光度。HFA 浓度越高，结合的检测抗体和 HRP 越多，TMB 氧化产物越多，吸光度越大。共价固定减少抗体流失和蛋白交换，提高信噪比与灵敏度。
检测灵敏度
LOD: 39 pg ml−1；EC50: 3 ng ml−1；工作/动态范围: 10–20,000 pg ml−1；%CV: 2.4–10.4；常规法 LOD: 625 pg ml−1；EC50: 23 ng ml−1；范围: 150–20,000 pg ml−1；%CV: 4.7–17.4
效应效果
该方案将 HFA 夹心 ELISA 的检出限从常规被动吸附法的 625 pg ml−1 降至 39 pg ml−1，灵敏度提高 16 倍；EC50 由 23 ng ml−1 降至 3 ng ml−1，工作范围由 150–20,000 pg ml−1 扩展至 10–20,000 pg ml−1，批内变异系数由 4.7–17.4% 降至 2.4–10.4%。共价固定提高抗体保留率，减少洗脱和蛋白交换，并赋予包被板长期储存稳定性。方法在醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和 Zeonex 等多种聚合物上均有效，适用于临床、工业和研究中的快速定量免疫检测，也可用于噬菌体展示抗体库筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：聚合物微孔板（PS、PMMA、PC、CA、Zeonex），提供固相载体与光学读取界面。
- 表面活化层：1% KOH 与 O2 等离子体处理，在聚合物表面生成 -OH/-CO 亲核位点。
- 胺化修饰层：2% APTES 真空硅烷化，形成 -O-Si- 键合的氨基（-NH2）自组装层。
- 识别元件：抗 HFA 捕获抗体，经 EDC/SulfoNHS 活化后与表面氨基共价偶联。
- 封闭剂：1% BSA/PBS，封闭剩余非特异结合位点。
- 信号标记物：生物素标记抗 HFA 检测抗体、链霉亲和素-HRP（SA-HRP）和 TMB-H2O2 底物。
中文摘要
本文报道一种适用于多种聚合物基质的快速高灵敏 ELISA 免疫检测方案。该方法首先用乙醇清洗微孔板，再以 1% KOH 和 O2 等离子体温和活化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、醋酸纤维素及 Zeonex 等表面，引入羟基/羰基；随后用 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在真空干燥器中胺化，形成氨基自组装层。利用 EDC/SulfoNHS 将捕获抗体共价固定于氨基表面，经 BSA 封闭后，依次加入人胎甲蛋白 A（HFA/AHSG）、生物素标记检测抗体和链霉亲和素-HRP，最后以 TMB-H2O2 显色并在 450/540 nm 读取吸光度。与被动吸附抗体相比，该共价固定 ELISA 的检出限由 625 pg ml−1 降至 39 pg ml−1，灵敏度提高约 16 倍，且可在多种化学惰性或活性聚合物上稳定使用，适用于临床、工业和抗体筛选等快速定量检测。
英文摘要
This protocol describes an improved and optimized approach to develop rapid and high-sensitivity ELISAs by covalently immobilizing antibody on chemically modified polymeric surfaces. The method involves initial surface activation with KOH and an O(2) plasma, and then amine functionalization with 3-aminopropyltriethoxysilane. The second step requires covalent antibody immobilization on the aminated surface, followed by ELISA. The ELISA procedure developed is 16-fold more sensitive than established methods. This protocol could be used generally as a quantitative analytical approach to perform high-sensitivity and rapid assays in clinical situations, and would provide a faster approach to screen phage-displayed libraries in antibody development facilities. The antibody immobilization procedure is of ∼3 h duration and facilitates rapid ELISAs. This method can be used to perform assays on a wide range of commercially relevant solid support matrices (including those that are chemically inert) with various biosensor formats.