组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
β-内酰胺抗生素（β-lactam antibiotics）：头孢噻肟（cefotaxime）、头孢曲松（ceftriaxone）、头孢他啶（ceftazidime）、头孢噻吩（cephalothin）、头孢西丁（cefoxitin）、头孢呋辛（cefuroxime）、青霉素G（penicillin G）、氨苄西林（ampicillin）等；样品基质：50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）溶液样品
检测原理
PenP-E166Cf中，Ω-loop上的E166C突变使去酰化步骤受阻，β-内酰胺抗生素进入催化位点后，Ser70侧链羟基对β-内酰胺环进行亲核攻击，形成稳定的ES*酰化加合物。apo状态下，偶联在Cys166上的环境敏感荧光素部分占据抗生素结合区域并处于受限/疏水微环境，荧光受抑。当抗生素结合并酰化时，其侧链与荧光素发生空间冲突，将荧光素从原位移出；为容纳该位移，Ω-loop由折叠状态变为完全柔性，使荧光素迁移至极性水环境中。荧光素在极性环境中发射增强，因此荧光强度随抗生素浓度升高而增加，0.01 μM cefotaxime可产生响应，1 μM左右饱和。信号放大主要来自酶催化酰化形成稳定中间体及Ω-loop构象变化导致的探针微环境改变。
检测灵敏度
LOD: 0.01 μM（cefotaxime，原文表述为可检测浓度）；饱和浓度: 1 μM；10 μM cefotaxime 荧光增强约25%；1 μM 多种β-内酰胺抗生素可诱导显著荧光增强
效应效果
该传感器在磷酸盐缓冲液中对多种β-内酰胺抗生素响应。ESI-MS显示>90% PenP被荧光素标记；10 μM cefotaxime使荧光增强约25%；头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻吩、头孢西丁、头孢呋辛、青霉素G、氨苄西林等9种抗生素在1 μM、100 s孵育后均显著增强。时间依赖实验显示cefotaxime 0.01 μM可检测，1 μM饱和。论文未报告RSD、稳定性、实际样品回收率或与ELISA/HPLC/qPCR对比。作者认为该机制可指导设计广谱β-内酰胺酶生物传感器，并可能筛选靶向Ω-loop的抑制剂。
传感器的构成
- 生物识别/换能元件：A类β-内酰胺酶PenP（Bacillus licheniformis 749/C），含Ser70催化残基，识别β-内酰胺环并形成酰化加合物
- 突变信号调节元件：Ω-loop E166C突变，降低去酰化效率，使酶停滞于ES*酰化中间体，放大荧光响应
- 信号标记物：环境敏感荧光素（fluorescein，fluorescein-5-maleimide），偶联于Cys166，在极性水环境中荧光增强
- 偶联化学：硫醚键（thiol linkage）连接荧光素马来酰亚胺基团与Cys166侧链，将探针定位在催化位点附近
- 信号读出：荧光光谱仪（Perkin-Elmer LS50B）监测荧光发射（约515 nm），输出荧光强度
- 检测介质：50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），维持酶构象与荧光素极性微环境
中文摘要
β-内酰胺酶与环境敏感荧光素偶联于催化位点附近Ω-loop第166位，是检测β-内酰胺抗生素的高效生物传感器，但其分子机制尚不清楚。本研究报道A类β-内酰胺酶PenP（来自Bacillus licheniformis 749/C）经E166C突变后在166位偶联荧光素的晶体结构，包括apo形式PenP-E166Cf及与cefotaxime形成的共价复合物PenP-E166Cf-cefotaxime，以阐明其生物传感机制。apo结构中，荧光素部分占据抗生素结合位点且高度动态。在cefotaxime复合物中，抗生素结合并酰化PenP，使荧光素从原位移出以避免空间冲突；该位移导致原本折叠良好的Ω-loop变为完全柔性，荧光素迁移至更溶剂暴露的极性环境，从而增强荧光发射。此外，完全柔性的Ω-loop使窄谱PenP能够以类似广谱β-内酰胺酶的方式结合cefotaxime。这些结构结果证实了荧光标记β-内酰胺酶的生物传感机制，为理性设计检测广谱β-内酰胺抗生素的β-内酰胺酶生物传感器提供依据，并提示荧光团偶联后Ω-loop柔性增加可用于筛选靶向Ω-loop的新型β-内酰胺酶抑制剂。
英文摘要
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