组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
AMPK 活性（AMPK activity）、细胞能量应激（cellular energy stress，以 AMP:ATP 比值反映）；样品基质：COS-7 细胞培养体系/细胞内液
检测原理
AMPKAR 为 FRET 荧光报告蛋白，包含可响应 AMPK 活性的识别/调节结构域以及供体-受体荧光蛋白对。当细胞经历能量应激（如 2-DG 处理诱导能量应激）时，AMP:ATP 比值升高并激活 AMPK；AMPK 活性变化通过 AMPKAR 的响应结构域传递，引起报告器构象变化，改变供体与受体荧光蛋白之间的距离或取向，从而改变 FRET 效率。FRET 比率随 AMPK 活性和能量应激程度变化，可被荧光成像实时读出。该体系不依赖酶催化沉积或核酸放大，而是通过蛋白构象介导的 FRET 变化实现信号转换；微流控葡萄糖饥饿/恢复可用于动态监测响应过程。
检测灵敏度
未报告
效应效果
补充材料显示 AMPKAR 对 AMPK 激活具有选择性：forskolin 诱导的 PKA 激活仅改变 AKAR3 的 FRET 信号，PMA 诱导的 PKD 激活仅改变 DKAR 信号，而 AMPKAR 信号不受影响。L-葡萄糖作为非代谢对照仅引起 FRET 比率轻微下降且无后续升高，提示 2-DG 的响应与糖代谢抑制相关。HPLC 测定细胞内 ATP 与 AMP 水平，表明 AMP:ATP 变化与 FRET 信号相关。微流控装置通过双入口调节葡萄糖饥饿与正常培养基界面，可动态控制细胞能量状态并用于成像监测。原文未报告 RSD、稳定性、回收率或与 ELISA/HPLC 定量对比。
传感器的构成
- 表达基质：COS-7 细胞，作为 AMPKAR 报告蛋白表达与 FRET 成像的细胞基底。
- 识别/响应元件：AMPKAR（AMPK activity reporter），响应 AMPK 活性/能量应激并产生 FRET 信号。
- 对照报告器：AKAR3（PKA reporter）与 DKAR（PKD reporter），用于验证 AMPKAR 对 AMPK 的特异性。
- 刺激/诱导剂：2-DG（2-deoxyglucose），诱导细胞能量应激并激活 AMPK；L-glucose 作为非代谢对照。
- 信号换能元件：FRET 供体-受体荧光蛋白对（AMPKAR 内），将 AMPK 活性转换为 FRET 比率变化。
- 样品控制装置：微流控装置（双入口、细胞接种通道），通过葡萄糖饥饿/正常培养基界面控制细胞能量状态。
- 验证读出：HPLC（高效液相色谱），测定细胞内 ATP 与 AMP 水平以关联 FRET 信号。
中文摘要
本文报道了一种用于实时监测 AMPK 活性和细胞能量应激的荧光 FRET 报告系统 AMPKAR。该报告器在 COS-7 细胞中表达，当细胞受到 2-脱氧葡萄糖（2-DG）诱导的能量应激时，AMPK 被激活并引起 AMPKAR 构象变化，导致 FRET 比率发生动态改变；L-葡萄糖对照仅引起轻微下降且无后续信号升高。HPLC 测定显示细胞内 AMP 与 ATP 水平变化及 AMP:ATP 比值与 FRET 信号相关。与 PKA 报告器 AKAR3 和 PKD 报告器 DKAR 的对照实验表明，AMPKAR 对 AMPK 激活具有选择性，不受 forskolin 诱导的 PKA 激活或 PMA 诱导的 PKD 激活干扰。此外，作者利用双入口微流控装置通过调节葡萄糖饥饿与正常培养基界面，实现细胞能量状态的动态控制与成像监测。
英文摘要
AMP-activated protein kinase (AMPK) is activated when the AMP/ATP ratio in cells is elevated due to energy stress. Here, we describe a biosensor, AMPKAR, that exhibits enhanced fluorescence resonance energy transfer (FRET) in response to phosphorylation by AMPK, allowing spatiotemporal monitoring of AMPK activity in single cells. We show that this reporter responds to a variety of stimuli that are known to induce energy stress and that the response is dependent on AMPK α1 and α2 and on the upstream kinase LKB1. Interestingly, we found that AMPK activation is confined to the cytosol in response to energy stress but can be observed in both the cytosol and nucleus in response to calcium elevation. Finally, using this probe with U2OS cells in a microfluidic device, we observed a very high cell-to-cell variability in the amplitude and time course of AMPK activation and recovery in response to pulses of glucose deprivation.