组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
碘化物（iodide, I-）、硫氰酸盐（thiocyanate, SCN-）、硝酸盐（nitrate, NO3-）、氯酸盐（chlorate, ClO3-）、高氯酸盐（perchlorate, ClO4-）、高铼酸盐（perrhenate, ReO4-）；样品基质：FRTL-5 甲状腺细胞培养液/PBS 灌注液中的细胞内液。
检测原理
FRTL-5 细胞膜上的 NIS 在 Na+ 电化学梯度驱动下将胞外 I-、SCN-、NO3-、ClO3-、ClO4-、ReO4- 主动转运入胞，使胞内阴离子浓度升高。胞内表达的 YFP-H148Q/I152L 在 Ser65/Tyr66/Gly67 生色团附近存在阴离子结合位点；阴离子结合改变生色团静电环境，促进质子化并改变表观 pKa，导致静态荧光猝灭。显微镜以 500 nm 激发、545 nm 发射检测荧光，相对荧光 RF=F/F0 随胞内阴离子浓度增加而下降。利用纯化 GST-YFP 测得的 K0.5 和 RFmin/RFmax，将 RF 转换为胞内浓度 [A-]i。NIS 的主动富集提供信号放大，使低胞外浓度也能产生可测荧光变化。
检测灵敏度
LOD（胞内）: 9 μM (ReO4-)、27 μM (ClO4-)、34 μM (I-)、29 μM (SCN-)、37 μM (ClO3-)、196 μM (NO3-)；最低可检测胞外浓度: 0.3 μM (ReO4-)、1 μM (ClO4-、I-)、3 μM (SCN-)、30 μM (NO3-、ClO3-)。
效应效果
该传感器在 FRTL-5 细胞中响应快速、可逆且重复暴露可重现；降低胞外 Na+ 可阻断阴离子诱导的荧光变化，BCECF 显示信号不来自胞内 pH 改变，15 mM Cl- 不干扰 YFP 敏感性。1 mM 阴离子使荧光下降 10%–70%，碘化物可被富集至胞外 30 倍以上。与放射性示踪、电生理和离子色谱-质谱相比，该方法可在单细胞水平实时监测多种 NIS 底物，并给出 Km、Vmax 和 Vmax/Km。所得动力学与放射/电生理估计一致，可用于 PBPK 模型、甲状腺及非甲状腺 NIS 组织研究、环境阴离子暴露风险评估和转运体药物筛选。
传感器的构成
- 细胞表达基底：FRTL-5 大鼠甲状腺滤泡细胞系，高表达 NIS，提供 NIS 底物摄取与胞内环境。
- 遗传编码修饰层：pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L 质粒经脂质体转染稳定表达，使 YFP 位于胞内作为传感器。
- 识别元件：YFP-H148Q/I152L 阴离子结合位点（Ser65/Tyr66/Gly67 生色团附近），结合 I-、SCN-、NO3-、ClO3-、ClO4-、ReO4- 后猝灭荧光。
- 转运/富集元件：细胞膜 NIS（sodium/iodide symporter），介导 Na+ 依赖的 NIS 底物内流并富集胞内浓度。
- 信号标记物：YFP-H148Q/I152L 荧光（激发 500±12.5 nm、发射 545±17.5 nm），阴离子结合后强度下降。
- 校准元件：GST-YFP-H148Q/I152L 融合蛋白（pGEX-4T-1/BL21(DE3)），用于测定各阴离子 K0.5 与最大猝灭。
- 缓冲/封闭环境：50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）含 300 mM 葡萄糖酸钠用于纯化蛋白校准；PBS 用于细胞灌注。
- 读出装置：Zeiss Axiovert 200 倒置显微镜、XBO 氙灯、Lambda 10C 滤光片切换器、XF104-2 YFP 滤光片组、CoolSNAP HQ CCD 与 MetaFluor 软件。
中文摘要
钠/碘化物同向转运体（NIS）主要负责甲状腺碘化物积累以合成甲状腺激素，也可转运硫氰酸盐、硝酸盐、氯酸盐、高氯酸盐和高铼酸盐等亲脂性阴离子。部分 NIS 底物具有生理或临床意义，另一些则是环境污染物。本研究评估黄色荧光蛋白变体 YFP-H148Q/I152L 作为生物传感器监测 NIS 底物细胞摄取的能力。纯化 YFP-H148Q/I152L 的荧光可被阴离子抑制，效价顺序为 ReO4- > ClO4- = I- = SCN- = ClO3- > NO3- > Cl-。在高表达 NIS 的 FRTL-5 甲状腺细胞中，阴离子同样引起荧光下降。通过细胞内浓度定量，作者获得了不同阴离子 NIS 介导摄取的亲和力、最大速度及被动外排速率常数差异。结果表明，YFP-H148Q/I152L 可作为 NIS 转运阴离子的细胞内荧光生物传感器，有助于研究内源阴离子生理及环境阴离子的健康效应。
英文摘要
The sodium/iodide symporter (NIS) is primarily responsible for iodide accumulation in the thyroid gland for the synthesis of thyroid hormones; however, it can also transport other lyotropic anions in the thyroid gland and nonthyroid tissues. Some NIS substrates have important physiological or clinical roles, and others are environmental contaminants with health-related consequences. The aim of this study was to assess the utility of a yellow fluorescent protein variant, YFP-H148Q/I152L, as a biosensor to monitor the cellular uptake of NIS substrates, including thiocyanate (SCN(-)), nitrate (NO(3)(-)), chlorate (ClO(3)(-)), perchlorate (ClO(4)(-)), and perrhenate (ReO(4)(-)). The fluorescence of purified YFP-H148Q/I152L was suppressed by anions with an order of potency of ReO(4)(-)>ClO(4)(-)=I(-)=SCN(-)=ClO(3)(-)>NO(3)(-)≫Cl(-). Anions also suppressed the fluorescence of YFP-H148Q/I152L expressed in FRTL-5, a thyroid cell line with high NIS expression. Quantitation of intracellular concentrations revealed differences among anions in the affinity and maximal velocity of NIS-mediated uptake as well as in the rate constant for passive efflux. These results suggest that YFP-H148Q/I152L can serve as an intracellular biosensor of NIS-transported anions and may be useful to study the physiology of endogenous anions as well as the health-related consequences of environmental anions.