组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
尿酸（uric acid/urate）；样品基质：人体生理体液（血清、尿液），实验校准使用30 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.9）
检测原理
重组酵母细胞内的尿酸酶（UOX）催化尿酸在氧气存在下氧化为别嘌醇和二氧化碳，同时氧气被还原生成过氧化氢（H2O2）。由于该菌株缺乏过氧化氢酶，H2O2 从细胞排出并透过透析膜扩散至电极表面的辣根过氧化物酶（HRP）层。HRP 催化 H2O2 还原为水，电子直接转移至石墨工作电极，在 -50 mV（vs Ag/AgCl）下产生安培电流。尿酸浓度升高时，UOX 反应生成的 H2O2 增多，HRP 催化还原产生的电子流增大，电流响应随之增强。透析膜允许尿酸、O2 和 H2O2 等小分子透过，同时固定细胞与酶，并避免尿酸在电极表面直接氧化造成干扰。该体系依靠 UOX-HRP 双酶级联和全细胞 UOX 过表达实现信号转换与增强。
检测灵敏度
LOD: 8 μM；线性范围: 180 μM
效应效果
该传感器具有较高尿酸盐选择性：对乙醇和抗坏血酸的相对交叉敏感约10%，对柠檬酸、L-乳酸、琥珀酸和D-葡萄糖无相对交叉敏感；作者认为干扰物在尿液中浓度低，影响可忽略。优化 HRP/细胞比例为1:1，Imax 210 nA，表观 KM 0.46–0.47 mM，响应时间1–1.2 min，短于 CAT 和 MP-11。最优 pH 8.5–8.9，温度36–42°C。与已有尿酸酶-微过氧化物酶金电极或尿酸酶-HRP石墨电极相比，LOD 8 μM，高于2 μM或0.6 μM，但线性范围180 μM，宽于75 μM或120 μM，KM 相近。作者强调其成本低，适合廉价尿酸盐选择性检测。
传感器的构成
- 工作电极：石墨棒电极（graphite rod, RW001，3.05 mm），环氧树脂密封于玻璃管中，暴露石墨圆盘，用于安培信号转导。
- 信号酶层：辣根过氧化物酶（HRP，300 U mL-1）滴涂于石墨表面并干燥，催化 H2O2 还原并将电子直接转移至电极。
- 生物识别层：重组 Hansenula polymorpha 菌株22细胞悬液（UOX 过表达，30 mg mL-1 DCW，30 mM Tris-HCl pH 8.9 含 1 mM EDTA），细胞内 UOX 氧化尿酸生成 H2O2。
- 固定隔离层：透析膜（cut off 10 kDa）与 O-ring 物理包埋固定 HRP 和细胞，允许尿酸、O2、H2O2 等小分子透过。
- 参比电极：Ag/AgCl/KCl（3 M）参比电极，用于恒电位安培测量。
- 对电极：Pt 丝对电极，构成三电极电化学测量回路。
- 反应介质：30 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.9），提供尿酸氧化与 HRP 催化反应环境。
中文摘要
尿酸盐在人体生理体液中的检测与定量对诊断和治疗嘌呤代谢异常相关疾病（如痛风和高尿酸血症）具有重要意义，而制备廉价可靠的尿酸盐选择性安培生物传感器仍具挑战性。本研究以重组热耐受甲基营养酵母 Hansenula polymorpha 细胞作为生物识别元件，开发了一种尿酸盐选择性微生物生物传感器。通过过表达 H. polymorpha 尿酸酶（UOX）基因构建 UOX 高产酵母，在裂解酵母细胞中初步筛选 UOX 活性升高的转化子，并确定使 UOX 产量最大化的培养条件，UOX 活性较亲本菌株提高约40倍。将 UOX 高产细胞与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，并通过透析膜物理包埋固定于石墨电极上。所得传感器具有较高尿酸盐选择性，检出限约为8 μM。结果表明，该策略可构建低成本、尿酸盐选择性微生物生物传感器。
英文摘要
BACKGROUND: The detection and quantification of uric acid in human physiological fluids is of great importance in the diagnosis and therapy of patients suffering from a range of disorders associated with altered purine metabolism, most notably gout and hyperuricaemia. The fabrication of cheap and reliable urate-selective amperometric biosensors is a challenging task.
RESULTS: A urate-selective microbial biosensor was developed using cells of the recombinant thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as biorecognition element. The construction of uricase (UOX) producing yeast by over-expression of the uricase gene of H. polymorpha is described. Following a preliminary screening of the transformants with increased UOX activity in permeabilized yeast cells the optimal cultivation conditions for maximal UOX yield namely a 40-fold increase in UOX activity were determined.The UOX producing cells were coupled to horseradish peroxidase and immobilized on graphite electrodes by physical entrapment behind a dialysis membrane. A high urate selectivity with a detection limit of about 8 μM was found.
CONCLUSION: A strain of H. polymorpha overproducing UOX was constructed. A cheap urate selective microbial biosensor was developed.