组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
激活态小GTPase（Rac1-GTP、K-Ras-GTP、Arf1-GTP、Arf6-GTP），样品基质为细胞裂解液或纯蛋白
检测原理
该传感器基于发光氧通道（LOC）原理。光敏剂修饰的供体微球在长波长激发下产生单线态氧（1O2），1O2可扩散至200 nm内的受体微球并激发其表面发光体，发射短波长光。当GTP结合态小GTPase同时被供体珠上的效应蛋白（如Pak1、RalGDS-RBD或GGA3）和受体珠上的抗体或His标签捕获时，供体与受体微球被拉近，1O2能量传递效率提高，发光信号增强；GDP结合态不能形成该桥接，信号低。微球表面高局部浓度使有效浓度升高，因此可在低于复合物Kd的浓度下定量。该均相体系无需洗脱，信号随激活态GTPase浓度增加而增强。
检测灵敏度
LQL: 200 pM；浓度极限: around 25 nM
效应效果
该LOC传感器在NIH 3T3细胞裂解液中可检测内源激活态Rac1，仅需0.05 mg/mL裂解液；pull-down需400 mg裂解液才可检出，40 mg及以下无信号，灵敏度至少提高10倍。streptavidin供体珠与生物素化GST-Pak1使Rac1-GTP最低定量限达200 pM，约为Kd（约30 nM）的1/100。体系可区分GTPγS与GDP，并扩展至K-Ras、Arf1和Arf6。88化合物筛选Z′值0.85，EHT1864使信号降至3s阈值以下，NSC23766无干扰，10 mM/3.3% DMSO下不淬灭单线态氧或散射光。
传感器的构成
- 供体微球：光敏剂修饰微球，表面GSH或streptavidin，用于固定效应蛋白并在长波长激发下产生单线态氧
- 受体微球：发光体修饰微球，表面protein A或Ni2+ chelate，用于固定抗体或His标签蛋白并发出光信号
- 识别元件（效应蛋白）：GST-Pak1(70-117)或biotinylated GST-Pak1，固定于GSH/streptavidin供体珠，特异性结合GTP结合态Rac1
- 识别元件（抗体）：anti-Rac1 mAB，固定于protein A受体珠，捕获Rac1 C端且不遮挡switch I
- 识别元件（其他GTPase）：GST-RalGDS-RBD或GST-GGA3，固定于供体珠，分别识别K-Ras-GTP或Arf1/Arf6-GTP
- 信号介质：单线态氧1O2，由光敏剂产生并在200 nm内传递能量至受体珠
- 信号读出：受体珠上的luminescer受1O2激发发射短波长光，作为定量信号
中文摘要
本文建立了一种基于发光氧通道（LOC）的均相生物传感器，用于定量检测小GTPase的激活状态。该体系由光敏剂修饰的供体微球和发光体修饰的受体微球组成：供体微球通过谷胱甘肽或链霉亲和素固定效应蛋白，受体微球通过蛋白A或Ni2+螯合固定抗体或His标签蛋白。当GTP结合态GTPase同时与效应蛋白和抗体结合时，供体与受体微球被拉近至200 nm以内，长波长激发产生的单线态氧可传递至受体微球并激发发光，从而产生可定量信号。作者以Rac1为模型，验证了该传感器在NIH 3T3细胞裂解液中检测内源激活态Rac1的能力，并扩展至K-Ras、Arf1和Arf6。该方法无需洗脱，灵敏度高，可用于高通量小分子筛选和多种GTPase激活状态分析。
英文摘要
We established a homogeneous luminescent oxygen channeling sensor for measuring activation states of small GTPases. The assay quantifies activated GTPases in cell lysates, can be applied to different GTPases, and can be used for multiplex screening. The study will provide guidelines for determining activation states of diverse GTPases in various biological contexts.