组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
p-硝基苯基磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate, p-NPP）；样品基质为 0.1 M 甘氨酸缓冲液（pH 10.5，含 0.1 M KCl 和 1 mM MgCl2）
检测原理
该传感器以固定化 ALP 作为生物催化识别元件。当 p-NPP 扩散进入电极界面时，ALP 催化其水解生成 p-硝基苯酚（p-NP）和磷酸。在 pH 10.5 的甘氨酸缓冲液中，p-NP 部分去质子化为带负电的 p-硝基苯酚盐（p-NP-）。在 +0.95 V 施加电位下，p-NP- 在金电极表面发生不可逆氧化，产生阳极电流。计时安培法记录电流随时间的变化，稳态电流大小与 p-NPP 浓度成正比。Cys SAM 和 GA 交联层用于固定 ALP 并维持其活性，同时允许底物和产物在界面扩散；信号放大主要依赖酶催化反应本身，未引入额外核酸或纳米酶放大策略。
检测灵敏度
LOD: 0.033 mM；线性范围: 0.05–0.6 mM；斜率: 2.615 mA/mM；R^2 = 0.985
效应效果
该传感器在 0.05–0.6 mM p-NPP 范围内呈线性响应，检出限为 0.033 mM，响应时间为 40 s。重复性实验中，0.2 mM p-NPP 连续 8 次进样，平均响应相当于 0.199 mM，标准偏差 0.0117 mM，变异系数 5.87%。优化结果显示，最佳 pH 为 10.5，最佳温度为 30 °C，Cys SAM 形成时间为 12 h，GA 浓度为 5%，ALP 用量为 32.5 U/mL；偏离这些条件时响应下降或线性变差。原文未报告选择性、抗干扰、实际样品加标回收率或与 ELISA/HPLC/qPCR 等方法的对比。作者认为该安培法可用于 p-NPP 测定，并因 ALP 高转换数和宽底物特异性，可拓展至 ALP 活性检测及免疫分析。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：腐石陶瓷基丝网印刷金电极（SPGE），金表面用于形成 SAM 并转导电子；参比/辅助电极：Ag/AgCl 和 AuPd(98/2%)，用于电位控制与电流回路
- 自组装修饰层：半胱胺（Cys）SAM，100 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.0 浸泡 12 h，在金表面形成含氨基单分子层
- 交联层：戊二醛（GA），5% 磷酸盐缓冲液 pH 7.0 处理 30 min，与 Cys 氨基交联以固定酶
- 生物催化元件：碱性磷酸酶（ALP），32.5 U/mL，Tris-HCl 缓冲液 pH 7.0 含 MgCl2 浸泡 22 h，催化 p-NPP 水解
- 反应介质/底物：p-硝基苯基磷酸盐（p-NPP），被测物；0.1 M 甘氨酸缓冲液 pH 10.5 含 0.1 M KCl 和 1 mM MgCl2
- 信号产物：p-硝基苯酚（p-NP）/p-硝基苯酚盐（p-NP-），在 +0.95 V 氧化产生阳极电流
- 信号读出：计时安培法（chronoamperometry），PalmSens 电化学工作站，+0.95 V vs Ag/AgCl
中文摘要
本文报道了一种基于碱性磷酸酶（ALP）的安培生物传感器。ALP 通过半胱胺（Cys）自组装单分子层（SAM）和戊二醛（GA）交联固定在腐石陶瓷基丝网印刷金电极表面。该传感器用于检测 p-硝基苯基磷酸盐（p-NPP）：ALP 催化 p-NPP 水解生成 p-硝基苯酚和磷酸，p-硝基苯酚在中等 pH 下失去质子形成 p-硝基苯酚盐，并在 +0.95 V 发生不可逆氧化，产生可被计时安培法测量的阳极电流。实验优化表明，最佳条件为甘氨酸缓冲液 pH 10.5、30 °C、SAM 形成 12 h、5% GA 和 32.5 U/mL 酶量。传感器响应与 p-NPP 浓度在 0.05–0.6 mM 范围内线性相关，响应时间为 40 s，检出限为 0.033 mM。
英文摘要
Alkaline phosphatase (ALP) was immobilized with cross-linking agents glutaraldehyde and cysteamine by forming a self-assembled monolayer on a screen printed gold electrode. ALP converts p-nitrophenyl phosphate to p-nitrophenol and phosphate. p-Nitrophenol loses H(+) ion and turns into the negatively charged compound p-nitrophenolate at medium pH. As a result, the unstable product formed is measured chronoamperometrically at an application potential of + 0.95 V. The biosensor response depends linearly on p-nitrophenyl phosphate concentration between 0.05 - 0.6 mM with a response time of 40 seconds. Detection limit of the biosensor is 0.033 mM.