An ultrasensitive electrochemical biosensor for detection of DNA species related to oral cancer based on nuclease-assisted target recycling and amplification of DNAzyme.

电化学生物传感器

口腔癌相关DNA（ORAOV1相关DNA，目标T1）；样品基质：唾液（saliva）

信号探针Sp固定于金电极并用MCH封闭。完全互补目标DNA与Sp杂交后形成双链，暴露N.BstNB I识别位点；N.BstNB I选择性切割Sp，使G-rich片段保留在电极表面，同时目标DNA释放并继续与新的Sp杂交，形成目标回收放大。洗涤去除被切割的识别片段后，血红素与G-rich序列结合形成G-四链体/血红素DNAzyme。该DNAzyme具有过氧化物酶样活性，催化H2O2氧化TMB，产生电活性产物并引起催化电流增大。目标浓度越高，电极表面G-rich片段越多，DNAzyme数量越多，电流信号越强；无目标时Sp不能形成G-四链体/血红素DNAzyme，背景低。单碱基错配会降低杂交稳定性或干扰酶切，从而降低信号。

LOD: 0.02 fM；线性范围: 0.08–8.0 fM

传感器对完全互补目标T1响应显著，对非互补序列T6无显著电流差异；对单碱基错配T2–T5的区分因子DF分别为7.1、11.6、12.9和22.9，表明错配位置影响杂交稳定性与酶切效率，尤其位于酶结合位点中心的T5区分度最高。8个同电极制备传感器检测1.0 fM的RSD为6.24%，3个不同电极制备传感器RSD为6.87%，重现性良好。作者认为与已报道方法相比，该方法检出限更低、选择性更好，可满足唾液临床诊断要求，并在纯缓冲液与唾液中比较显示其可用于唾液直接检测，有望用于口腔癌无创早期诊断。

本文报道了一种简单、无标记、超高灵敏且高选择性的电化学生物传感器，用于唾液中口腔癌相关DNA物种（ORAOV1）检测。该传感器以金电极为基底，3′端巯基修饰的信号探针（Sp）通过S–Au键固定，并用2-巯基乙醇（MCH）封闭形成混合单分子层。Sp包含目标识别序列和富含G序列，且识别序列内嵌N.BstNB I切口内切酶识别位点。当完全互补目标DNA存在时，其与Sp杂交形成双链并暴露完整酶切位点；切口内切酶选择性切割Sp，使富含G片段保留在电极表面，目标DNA释放并循环催化多个探针转化。随后血红素（hemin）与G四链体结合形成G-四链体/血红素DNAzyme，催化H2O2氧化TMB，产生增强电流和颜色变化。该策略实现目标回收放大，可检测0.02 fM目标DNA，线性范围为0.08–8.0 fM，对单碱基错配具有良好区分能力，有望用于唾液口腔癌无创早期诊断。