组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
未指定单一检测对象；示例结合分析物：链霉亲和素（streptavidin）、抗GFP抗体（anti-GFP antibody）、S-protein、IgG；样品基质：HBS-EP缓冲液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.5% P20，pH 7.4）
检测原理
CM5 SPR芯片的金表面覆盖羧甲基葡聚糖，羧基经EDC/NHS活化后与保护连接子偶联，再经甲氧胺或磷酸盐去保护，暴露N端半胱氨酸或氨基氧基。C端硫酯肽/蛋白与表面N端半胱氨酸发生天然化学连接，形成酰胺键；N端醛/酮肽/蛋白与氨基氧基在苯胺催化下形成肟键，实现位点特异性、均一取向固定。固定化配体与目标分析物结合后，界面质量/折射率增加，SPR共振角发生偏移，以共振单位（RU）读出。该方法无额外化学信号放大，但可通过改变注射时间或多次注射逐步调节固定密度，从而控制表面响应。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率、相关系数。
效应效果
与常规氨基偶联相比，NCL和肟连接可获得均一取向的配体呈现，避免异质固定导致的表面/溶液数据不一致。示例中GFP固定量为480 RU，并可被抗GFP抗体特异性结合；S-peptide固定130 RU后可结合S-protein。Protein G'固定20 RU时，经典氨基偶联仅结合17 RU IgG，而肟连接固定同样20 RU可结合97 RU IgG，接近1:1预期的130 RU。肟连接固定20 RU Protein G'仅需36 s，而经典氨基偶联需5 min。肟键在中性条件下稳定，过夜流式无显著下降；NCL表面若发生半胱氨酸氧化可致基线漂移，可用TCEP/DTT或DTNB处理。方法适用于Biacore及其他SPR仪器。
传感器的构成
- 基底/换能器：金基底（gold substrate）与羧甲基葡聚糖层（CM5 dextran），提供SPR换能表面和可活化羧基
- 活化层：EDC/NHS（1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide/N-hydroxysuccinimide）活化羧基，形成NHS酯用于胺偶联
- 连接子修饰层：噻唑啉保护半胱氨酸连接子（thiazolidine-protected cysteine linker, 4）或t-Boc保护氨基氧基连接子（t-Boc-protected aminooxy linker, 8），经EDC/NHS偶联到CM5表面
- 识别基团：去保护后暴露的N端半胱氨酸（N-terminal cysteine）或氨基氧基（aminooxy group），分别用于NCL和肟连接
- 识别元件：C端硫酯多肽/蛋白（如SLLAHPQGGG-MPAL、GFP-MESNA thioester）或N端醛/酮多肽/蛋白（S-peptide、Protein G'），作为固定化配体
- 封闭剂：乙醇胺盐酸盐（ethanolamine HCl）封闭未反应羧基，降低非特异结合
- 反应助剂：MPAA/TCEP用于NCL硫酯保护与还原，苯胺醋酸盐（anilinium acetate）催化肟连接
- 信号读出：SPR共振单位（RU）直接监测表面质量/折射率变化，无需额外标记
中文摘要
蛋白质和多肽在传感器表面的位点特异性固定是表面等离子共振（SPR）等生物分析应用中的关键挑战。常规共价固定通常靶向蛋白表面的氨基或巯基，导致配体在表面呈现异质取向，有时会使表面结合数据与溶液相数据不一致。本章讨论两种互补且通用的生物偶联方法，实现多肽和蛋白质通过C端（天然化学连接，NCL）或N端（肟连接）进行化学选择性固定。NCL利用C端硫酯肽或蛋白与表面N端半胱氨酸在温和水相条件下自发形成酰胺键；肟连接利用N端醛或酮与表面氨基氧基在苯胺催化下形成肟键。作者给出了制备半胱氨酸或氨基氧基功能化SPR芯片、制备C端硫酯或N端醛/酮蛋白/多肽以及典型结合实验的详细方案。虽然方案针对Biacore仪器设计，但也可推广至其他SPR仪器及依赖蛋白功能化表面的生物分析应用。
英文摘要
Site-specific immobilization of proteins and peptides on a sensor surface represents a significant challenge for bioanalytical applications such as surface plasmon resonance (SPR). The most common protocols for covalent protein immobilization usually result in heterogeneous presentation of the ligand at the surface, which can in some instances yield conflicting results with analogous data obtained in solution. Here, we discuss two complementary and generic bioconjugation methods that allow chemoselective immobilization of peptides and proteins via either their C-terminus (native chemical ligation) or their N-terminus (oxime ligation). While the protocols described in this chapter were designed for use in a Biacore instrument, the methods should also be applicable to other SPR instruments and, with slight adjustments, to many other types of bioanalytical applications that rely on protein-functionalized surfaces.