组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
突变型K-ras癌基因第12密码子单碱基突变DNA（mutant K-ras codon 12 DNA）；样品基质：DNA溶液/基因组DNA片段（经限制酶、超声或DNase预处理）
检测原理
发夹DNA探针固定于羧基化磁性微球，与生物素标记报告探针共同识别目标DNA。突变型K-ras第12密码子目标DNA与两条探针完全匹配时，T4 DNA连接酶连接发夹探针5′-磷酸和报告探针3′-羟基，形成稳定双链结构；短引物结合打开的发夹探针，Klenow Fragment (exo−)聚合酶在dNTPs存在下延伸，通过链置换释放目标DNA。释放的目标DNA再与另一磁珠捕获的发夹探针和报告探针杂交，触发下一轮连接-延伸-置换循环，实现环状链置换信号放大。野生型目标因单碱基错配不能被连接，延伸使报告探针从磁珠脱离，经磁分离后无HRP结合，背景显著降低。保留在磁珠上的生物素报告探针经链霉亲和素-HRP结合，HRP催化鲁米诺-H2O2-PIP反应产生化学发光，发光强度随突变目标浓度增加。
检测灵敏度
LOD: 1.3 × 10−16 M；线性范围: 5.0 × 10−16–5.0 × 10−14 M；回归方程: ΔI = 4.212 log C − 0.74811（C为突变目标浓度，10−16 M）；相关系数: 0.9985
效应效果
优化条件下，50 μg羧基化磁性微球和8 μL 10−8 M HRP可获得较高化学发光增强与较低背景。选择性方面，在1.0×10−13 M野生型DNA存在下，方法可定量检测2.5×10−16–1.0×10−14 M突变型DNA，最低可检测1:400等位基因频率（突变2.5×10−16 M）。野生型目标因T4 DNA连接酶不能连接，报告探针被链置换并从磁珠脱离，经磁分离后不产生发光，从而降低异合子样品背景。作者指出灵敏度与已报道SNP方法相当或更好，并可在25℃等温条件下用于经限制酶、超声或DNase预处理后的基因组DNA片段。磁珠载体有利于高通量筛查，结合不同探针的微阵列有望同时检测多种SNP。原文未报告长期稳定性、RSD或实际样品加标回收率。
传感器的构成
- 基底/载体：羧基化磁性微球（carboxylated magnetic beads, 3–4 μm），提供固相载体并用于磁分离。
- 活化偶联层：EDC/NHS，活化羧基并与氨基修饰发夹DNA形成酰胺键。
- 识别元件：氨基修饰发夹DNA探针（NH2-hairpin DNA probe, 5′-PO4），识别目标DNA并打开发夹。
- 报告识别元件：生物素标记报告DNA探针（biotinylated reporter DNA probe），与目标3′端杂交并携带生物素。
- 酶识别元件：T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase），识别突变位点完全匹配并连接相邻探针。
- 信号放大元件：短引物（primer）、Klenow Fragment (exo−)聚合酶、dNTPs，引发链置换聚合扩增。
- 信号标记物：链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），结合生物素报告探针。
- 化学发光底物：鲁米诺（luminol）、H2O2、对碘苯酚（PIP），HRP催化产生化学发光。
- 封闭剂：2%牛血清白蛋白（BSA），封闭磁珠非特异结合位点。
中文摘要
单核苷酸多态性（SNP）基因分型与癌症等疾病密切相关。本文报道了一种基于环状链置换扩增和磁性微球分离的室温高灵敏化学发光生物传感器，用于DNA点突变检测。氨基修饰发夹DNA探针经EDC/NHS偶联固定在羧基化磁性微球上，与生物素标记报告探针和目标DNA形成夹心结构。当突变型K-ras癌基因第12密码子目标DNA与探针完全匹配时，T4 DNA连接酶连接发夹探针5′-磷酸和报告探针3′-羟基；引物结合后，Klenow Fragment (exo−)聚合酶在dNTPs存在下延伸并置换目标DNA。被置换的目标DNA再与另一磁珠捕获的发夹探针和报告探针杂交，触发下一轮链置换扩增。野生型目标因错配不能连接，报告探针被置换并从磁珠脱离，经磁分离后不产生化学发光，从而降低背景。结合生物素的报告探针经链霉亲和素-HRP识别，HRP催化鲁米诺-H2O2-对碘苯酚反应产生化学发光。方法检出限为1.3×10−16 M，灵敏度优于多数已报道SNP检测方法，并有望用于人类基因组SNP高通量筛查。
英文摘要
Single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping is attracting extensive attentions owing to its direct connections with human diseases including cancers. Here, we have developed a highly sensitive chemiluminescence biosensor based on circular strand-displacement amplification and the separation by magnetic beads reducing the background signal for point mutation detection at room temperature. This method took advantage of both the T4 DNA ligase recognizing single-base mismatch with high selectivity and the strand-displacement reaction of polymerase to perform signal amplification. The detection limit of this method was 1.3 × 10(-16)M, which showed better sensitivity than that of most of those reported detection methods of SNP. Additionally, the magnetic beads as carrier of immobility was not only to reduce the background signal, but also may have potential apply in high through-put screening of SNP detection in human genome.