组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
Cy5标记绿色荧光蛋白（Cy5-GFP）；样品基质：磷酸盐缓冲液（PBS，含0.05% Tween 20）
检测原理
双特异性抗体4F2-GFP4VHH通过抗ZnO VHH高密度固定于ZnO层，其抗GFP VHH特异性结合样品中的Cy5-GFP。He-Ne激光从芯片背面以共振角入射，在Ag光栅界面激发表面等离子体极化激元，局部电场增强使Cy5荧光激发效率提高；发射荧光再与表面等离子体极化激元发生反向耦合，在±7°方向形成增强荧光峰。结合量随Cy5-GFP浓度增加而增加，因此反向耦合峰强度与浓度呈定量关系。ZnO层抑制非特异吸附和荧光猝灭，提高信噪比。
检测灵敏度
LOD: 7 pM；线性范围: 100 nM–10 pM
效应效果
该芯片在220 nM Cy5-GFP下相对ZnO玻璃载片的荧光增强因子为100倍，10 pM样品经10 min孵育即可检出，LOD为7 pM，与高灵敏ELISA相当；相比一般SPR方法灵敏度提高约1000倍。非特异吸附方面，100 nM时Cy5-BSA、无抗体Cy5-GFP和Cy5-溶菌酶相对特异结合的比例分别为17%、1%和<1%，100 pM时均不可检出。作者认为ZnO表面选择性和低非特异吸附使其有望用于人血清或全血等复杂基质中的临床诊断芯片。
传感器的构成
- 基底/光栅换能器：PMMA光栅基底（UV-NIL制备，PAK-02-A光固化树脂，周期500 nm、沟深31 nm、占空比0.68），提供光栅耦合表面等离子体极化激元
- 金属等离激元层：Cr粘附层与Ag薄膜（Ag厚约37 nm），激发表面等离子体共振并增强局部激发场
- 抗非特异/抗猝灭层：ZnO薄膜（厚约17 nm），抑制蛋白非特异吸附和荧光猝灭，同时作为抗体固定界面
- 识别元件：双特异性抗体4F2-GFP4VHH（anti-ZnO 4F2 VHH与anti-GFP cAbGFP4VHH融合），高密度固定于ZnO表面并特异性结合GFP
- 信号标记物：Cy5标记GFP（Cy5-GFP，标记比3.9），作为荧光标记抗原
- 样品缓冲液：PBS（10 mM磷酸盐pH 7.5/200 mM NaCl，含0.05% Tween 20），用于孵育与冲洗
- 读出系统：角度分辨荧光检测（He-Ne激光632.8 nm激发，PMT/θ-2θ测角，反向耦合角±7°荧光峰）
中文摘要
本研究制备了一种由银包覆PMMA光栅并覆盖氧化锌（ZnO）层的等离激元生物传感器芯片，用于通过表面等离子体场增强荧光（SPF）检测Cy5标记的绿色荧光蛋白（GFP）。实验室制备的双特异性抗体（抗GFP×抗ZnO抗体）被高密度固定于传感器芯片表面，用于GFP检测。由于抗体密集排列以及ZnO涂层能够抑制非特异性蛋白吸附和荧光猝灭，等离激元生物传感器的灵敏度得到提高。利用该ZnO包覆等离激元芯片，可通过SPF检测到10 pM的Cy5标记GFP。与ZnO包覆玻璃载片上的普通荧光检测相比，其灵敏度提高约100倍。该芯片基于光栅耦合表面等离子体共振结构，在共振角激发增强电场，并通过反向耦合模式增强荧光读出，从而实现对抗原—抗体相互作用的快速、高灵敏定量检测。
英文摘要
A plasmonic biosensor chip of silver-coated PMMA grating with a zinc oxide (ZnO) overlayer is fabricated for surface plasmon field-enhanced fluorescence (SPF) detection of Cy5-labeled green fluorescent protein (GFP). A bispecific antibody (anti-GFP x anti-ZnO antibody) prepared in our lab is densely immobilized on the sensor chip for GFP detection. The sensitivity of the plasmonic biosensors is improved due to densely packed antibodies and ZnO-coating that suppresses nonspecific protein adsorption and fluorescent quenching. With the ZnO-coated plasmonic chip, Cy5-labeled GFP of 10 pM can be detected through SPF. This sensitivity is 100 higher compared with the normal fluorescent detection on a ZnO-coated glass slide.