组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）、咖啡酸（caffeic acid）；样品基质：0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）
检测原理
WRK选择性修饰Tyr表面羧基形成烯醇酯，并与氧化活化GC表面的羟基/酚羟基共价连接，使Tyr保持天然构象并贴近电极。Tyr活性中心的Cu(II)/Cu(I)电对与GC之间发生直接电子转移，无需介质。检测L-DOPA时，Tyr催化L-DOPA氧化生成邻醌，同时酶被还原；生成的邻醌在-200 mV下于电极表面被还原，产生还原电流。底物浓度越高，酶促氧化产生的邻醌越多，稳态还原电流越大。Nafion外层提供亲水微环境、增强电子传递可逆性并防止醌使酶失活，从而放大和稳定信号。
检测灵敏度
LOD: 9.0×10−5 M；线性范围: 1.66×10−6–8.5×10−5 M；灵敏度: 135 mA μM−1 cm−2；回归斜率: 4.26 nA μM−1；R² = 0.9977
效应效果
该传感器响应时间小于10 s（达到95%稳态响应）。在100 mV s−1循环伏安测试中，连续50次循环后WRK-Tyr峰高保留95%以上，峰电位不变；4 ℃储存2周后CV无明显变化，表明共价固定和Nafion保护赋予良好操作与储存稳定性。以WRK修饰BSA为对照未出现伏安响应，说明信号来自Tyr的Cu(II)/Cu(I)电对，具有较好特异性。Nafion层可防止醌类产物与酶游离氨基反应导致失活。作者认为该策略可用于其他含铜酶的直接电化学和酚类底物检测，但尚未报道实际样品加标回收率、RSD及与ELISA/HPLC/qPCR等方法的对比。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻璃碳电极（glassy carbon, GC），经氧化铝抛光并在+1.5 V下氧化活化，作为电子换能器并提供表面亲核基团。
- 电极表面活化层：氧化活化产生的羟基/酚羟基（-OH/-O-），与WRK-Tyr烯醇酯反应实现共价连接。
- 化学修饰/连接层：伍德沃德试剂K（Woodward's reagent K, WRK）修饰Tyr羧基形成烯醇酯，作为共价连接桥。
- 识别/催化元件：蘑菇酪氨酸酶（mushroom tyrosinase, Tyr），含Cu(II)/Cu(I)活性中心，催化L-DOPA/咖啡酸氧化并直接电子转移。
- 外层聚合物：Nafion（全氟磺酸聚合物，5%乙醇溶液），覆盖在WRK-Tyr外，提供微环境、增强可逆性并保护酶。
中文摘要
本文报道了利用伍德沃德试剂K（Woodward's reagent K, WRK）对酪氨酸酶（tyrosinase, Tyr）进行化学修饰并将其共价固定于氧化活化玻璃碳（glassy carbon, GC）电极表面的反应机制。紫外-可见光谱、圆二色光谱和荧光探针实验表明，WRK修饰未引起Tyr二级结构和催化活性的显著变化。固定于氧化活化GC电极后，Tyr实现了直接电化学，循环伏安曲线呈现一对准可逆峰，对应活性位点Cu(II)/Cu(I)氧化还原电对；在pH 7.0磷酸盐缓冲液中，表观形式电位为90 mV（vs. Ag/AgCl），电荷转移系数和表观异相电子转移速率常数分别为0.5和0.9±0.06 s−1。进一步研究了固定化酶对咖啡酸和L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）的电化学行为。安培法检测L-DOPA在1.66×10−6至8.5×10−5 mol/L范围内呈线性响应，检出限为9.0×10−5 mol/L，灵敏度为135 mA μM−1 cm−2。
英文摘要
This work describes the reaction mechanism for chemical modification of tyrosinase by Woodward's Reagent K and its covalent attachment to a glassy carbon electrode. The spectrophotometric studies revealed that the modification does not cause a significant structural change to tyrosinase. The direct electrochemistry of modified enzyme was achieved after immobilization on an oxidatively activated glassy carbon electrode. The enzyme film exhibited a pair of well-defined quasi-revesible voltammetric peaks corresponding to the Cu (II)/Cu (I) redox couple located in the active site of tyrosinase. The formal potential of immobilized enzyme was measured to be 90mV (vs. Ag/AgCl) in phosphate buffer solution at pH 7.0. The charge-transfer coefficient and apparent heterogeneous electron transfer rate constant were estimated to be 0.5 and 0.9±0.06s(-1), respectively. Finally, the electrochemical behavior of the immobilized enzyme in the presence of caffeic acid and L-3,4-dihydroxyphenylalanine as substrates was investigated. The amperometric study of biosensor toward L-3,4-dihydroxyphenylalanine resulted a linear response in the concentration range from 1.66×10(-6) to 8.5×10(-5)M with detection limit of 9.0×10(-5)M and sensitivity of 135mAμM(-1)cm(-2).