组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）；样品基质：PBS标准溶液、神经元细胞裂解液（A172/C6细胞）
检测原理
传感器以共价固定的抗iNOS抗体为识别元件，特异性捕获样品中的iNOS。iNOS与抗体结合后形成免疫复合物，改变电极/溶液界面双电层及电荷转移特性，使阻抗降低；同时AuNP/polyTTBA纳米复合层提供导电通道，使iNOS内部FAD/FMN/血红素介导的电子可直接转移至金电极。在-0.4 V计时电流下，iNOS被还原产生稳态电流，电流随iNOS浓度增加而增大。该体系无需外加氧化还原探针或酶标记，依靠抗体识别和直接电子转移实现检测。
检测灵敏度
LOD: 0.20 ±0.04 ng/mL；线性范围: 0.001–0.02 μg/mL；灵敏度斜率: 59.4 ±0.3 μA/μg mL−1；R^2 = 0.997
效应效果
选择性良好：0.2 mM多巴胺、0.1 mM BPA、0.1 μM L-精氨酸、抗坏血酸、硝酸根和NO无明显干扰；2.5倍浓度nNOS（0.5 μg/mL）存在时iNOS电流下降<3.0%。可重复使用8次，RSD为5.4%（体外）和6.2%（生物介质）；4°C PBS保存2个月，第1个月损失约5%，第2个月下降约30%。95%稳态电流约15 s达到。与标准ELISA相比，检出限低约3个数量级。A172细胞裂解液中，2.0×10^6细胞响应8.3±0.3 μA，再注入3.0×10^6细胞增加10.4±0.2 μA，加0.1 μM BBS-2下降2.4±0.2 μA，可用于细胞iNOS监测。
传感器的构成
- 基底电极：抛光金电极（Au electrode），作为工作电极提供电子转移界面
- 纳米修饰层：5 nm金纳米粒子（AuNPs）自组装TTBA单体层，经电聚合形成polyTTBA包覆AuNP纳米复合层（AuNP(TTBA)），提供高比表面积、导电通道和羧基
- 偶联活化剂：EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺），活化polyTTBA层羧基，使抗体氨基形成酰胺键
- 识别元件：抗iNOS抗体（anti-iNOS IgG），共价固定于AuNP(TTBA)层，特异性结合iNOS
- 封闭剂：BSA（牛血清白蛋白，1% BSA/PBS），封闭剩余活性位点，降低非特异吸附
- 信号元件：无外加标记物，iNOS自身FAD/FMN/血红素介导直接电子转移（DET）产生电流
- 工作介质：0.1 M PBS（pH 7.4），维持生理环境并传导离子
- 电极体系：Ag/AgCl参比电极与Pt丝对电极（或微Ag/AgCl），用于CV、EIS和计时电流测量
中文摘要
本文报道了一种金纳米粒子(AuNP)包覆导电聚合物的新型纳米结构，并将其作为生物传感器探针材料用于检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)浓度。作者合成了2,2′:5′,5″-三噻吩-3′-苯甲酸(TTBA)单体，使其自组装到AuNP表面，并考察AuNP尺寸及TTBA单体膜厚度对电极导电性的影响。随后，抗iNOS抗体通过共价键结合到自组装TTBA包覆AuNP的聚合物层上。利用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)直接观察iNOS与抗iNOS形成的免疫复合物。结果表明，自组装TTBA层对iNOS具有高效电化学响应；电流响应与iNOS浓度在0.001–0.02 μg/mL范围内呈线性关系，校准灵敏度为59.4 ±0.3 μA/(μg·mL−1)，检出限为0.20 ±0.04 ng/mL（95%置信水平，k=3，n=5）。进一步结果表明，AuNP包覆导电聚合物是优良纳米结构生物传感器探针材料，具有应用于细胞生物传感器的潜力。
英文摘要
Novel nanostructures of gold nanoparticle (AuNP) encapsulated-conductive polymer have been developed to study biosensor probe materials and utilized to detect the concentration of inducible nitric oxide synthase (iNOS). A 2,2':5',5″-terthiophene-3'-benzoic acid (TTBA) monomer was synthesized and self-assembled on gold nanoparticles (AuNPs). The size effects of the AuNPs and TTBA monomer film thickness on the electrode conductivity were examined. Anti-iNOS antibody was covalently bound on an encapsulated-AuNPs polymer layer with self-assembled TTBA. The immunocomplex formation between iNOS and anti-iNOS was directly observed by cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). This study looked at the applicability of the self-assembled TTBA layer where the results indicated an efficient electrochemical response toward iNOS. The calibration plot of the current response vs. iNOS concentration exhibited a linear relationship in the range of 0.001-0.02 μg/mL. The calibration sensitivity of iNOS was 59.4 ± 0.3 mV/μg mL(-1). The detection limit of iNOS was determined to be 0.20 ± 0.04 ng/mL based on five time measurements (95% confidence level, k = 3, n = 5). Further results show that AuNP-encapsulated conductive polymers are good nanostructured materials as biosensor probes and have a potential application in cell biosensors.