组成图示
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传感器类型
其他（电容生物传感器）
检测对象
无机磷酸盐（inorganic phosphate, Pi；KH2PO4），样品基质为 10 mM Tris–HCl（pH 7.5）缓冲液/流动注射溶液
检测原理
该传感器以固定于金电极 SAM 上的 Pho84 膜蛋白为识别元件。当样品中的无机磷酸盐（Pi）与 Pho84 结合时，转运蛋白发生由外翻、内翻到封闭态的构象变化，使绝缘电极表面的介电层厚度/离子分布改变。电容式换能器通过向工作电极施加 50 mV 电位脉冲，测量电极/溶液界面电容；Pi 结合引起的构象变化导致电容增加，且随 Pi 浓度升高而增大。由于未使用脂质膜，蛋白依靠表面活性剂维持三维结构，仍保留选择性结合。磷酸盐类似物甲基膦酸仅诱导轻微构象变化，硫酸铵无响应，因此信号主要反映 Pi 特异性结合。在 5–25 μM 范围内 ΔC 与浓度线性相关，高浓度下电极趋于饱和。
检测灵敏度
线性范围: 5–25 μM
效应效果
该传感器对无机磷酸盐具有选择性：硫酸铵注入无浓度依赖信号；甲基膦酸（5.5–27.5 μM）与 100 μM KH2PO4 交替注入时仅产生较小响应，说明 Pho84 优先识别 Pi。脉冲注入中保留时间随 Pi 浓度增加而延长，25 μM 以上趋于饱和，与文献报道的高亲和力 Pho84 Km 约 24 μM 一致；连续注入 10 mM KH2PO4 时电容稳定，表明超过 5 mM 时饱和。释放后电容下降，无需单独再生。论文未报告 RSD、实际样品回收率或与 ELISA/HPLC 的对比，但作者认为该结果证明纯化膜蛋白可在无脂质膜环境中保持构象动力学并用于磷酸盐传感。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：Dropsens® 金电极（DRP-220AT）作为工作电极，提供电容换能界面。
- 绝缘自组装单分子层：硫辛酸（thioctic acid）在金表面形成 SAM，绝缘电极并提供羧基。
- 活化层：EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）活化 SAM 羧基，用于固定蛋白。
- 识别元件：异源表达纯化 Pho84（His6/Xpress-Pho84-FLAG）磷酸盐/质子同向转运蛋白，结合 Pi 并发生构象变化。
- 封闭层：十二烷硫醇（dodecanethiol）封闭 SAM 针孔，完善绝缘。
- 样品引入系统：流动注射分析（FIA）系统，10 mM Tris–HCl（pH 7.5）运行缓冲液，0.25 mL 注射环引入 KH2PO4。
- 信号读出：三电极体系（金工作电极、Ag/AgCl 参比电极、铂辅助电极）连接电位计，施加 50 mV 电位脉冲并记录电容变化。
中文摘要
本研究开发了一种基于电位阶跃电容测量的无标记无机磷酸盐直接检测生物传感器。该传感器以酿酒酵母高亲和力质膜磷酸盐/质子同向转运蛋白 Pho84 作为识别元件。异源表达并纯化的 Pho84 蛋白被固定于电容电极表面的自组装单分子层（SAM）上。与磷酸盐类似物甲基膦酸相比，电极暴露于磷酸盐时记录到明显的电容变化。结果表明，即使未使用脂质膜，Pho84 仍保持选择性底物结合能力，其磷酸盐检测限处于表观体内 Km 范围。在 5–25 μM 磷酸盐浓度范围内，电容随浓度呈线性增加。该电容生物传感器的分析响应与转运蛋白在无机磷酸盐作用下发生显著构象变化、而类似物仅引起轻微响应的机制一致。
英文摘要
A label free biosensor for direct detection of inorganic phosphate based on potential-step capacitance measurements has been developed. The high-affinity Pho84 plasma membrane phosphate/proton symporter of Saccharomyces cerevisiae was used as a sensing element. Heterologously expressed and purified Pho84 protein was immobilized on a self-assembled monolayer (SAM) on a capacitance electrode. Changes in capacitance were recorded upon exposure to phosphate compared to the control substance, phosphate analogue methylphosphonate. Hence, even without the explicit use of lipid membranes, the Pho84 membrane protein could retain its capacity of selective substrate binding, with a phosphate detection limit in the range of the apparent in vivo K(m). A linear increase in capacitance was monitored in the phosphate concentration range of 5-25 μM. The analytical response of the capacitive biosensor is in agreement with that the transporter undergoes significant conformational changes upon exposure to inorganic phosphate, while exposure to the analogue only causes minor responses.