组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
花生四烯酸（arachidonic acid, AA）；样品基质：磷酸盐缓冲液（KPi）和人血浆（human plasma）
检测原理
该传感器采用双模态光学换能。IANBD amide荧光探针通过硫醚键共价连接于BMP的Cys62位点，BMP固定于多孔硅孔道内。当花生四烯酸（AA）结合BMP活性位点时，B′、F、G、H、I等螺旋发生构象重排，改变Cys62附近探针的微环境，使540 nm荧光发射增强，荧光变化与AA浓度相关。同时，AA渗入多孔硅孔道改变膜层平均折射率，导致可见光反射干涉条纹移动，提供第二条信号通道。荧光法在低浓度区更敏感，折射率法在10–200 μM范围线性更好；两种信号联用可交叉验证结合事件，提高准确度、扩展动态范围并降低假阳性。
检测灵敏度
LOD: 10 μM（荧光法）；LOD: 30 μM（折射率法）；线性范围: 10–100 μM（荧光法，R^2 = 0.9952）；动态范围: 10–200 μM（荧光法二阶拟合 R^2 = 0.9955；折射率法 R^2 = 0.9861）；血浆线性范围: 50–200 μM（荧光法 R^2 = 0.9925；折射率法 R^2 = 0.9998）；折射率法斜率: 0.017（缓冲液）/0.0075（血浆）
效应效果
在缓冲液中，荧光法对低浓度AA更敏感，LOD 10 μM，10–100 μM线性（R^2=0.9952），100 μM以上趋于饱和；折射率法在10–200 μM线性（R^2=0.9861），LOD 30 μM。人血浆加标50、100、200 μM时，两种方法均保持线性，荧光法R^2=0.9925，折射率法R^2=0.9998，表明在蛋白、葡萄糖、凝血因子、矿物离子和激素等干扰物存在下仍具良好选择性。血浆中荧光斜率略低于缓冲液，折射率斜率由0.017降至0.0075，提示非特异吸附影响折射率灵敏度。作者认为双模态联用可提高准确度、扩展动态范围并避免假阳性；相比HPLC需p-溴苯乙酮衍生化，本方法可在7–250 μM范围直接定量AA，可作为凋亡筛查的替代或补充方法。
传感器的构成
- 基底/换能器：p+掺杂单晶硅片（Si，<100>，硼掺杂，8–12 mΩ cm）经脉冲阳极刻蚀形成多孔硅（PS）薄膜，厚度2.5–5 μm、孔径约50 nm，作为光学换能器和蛋白载体
- 氧化活化层：热氧化生成SiOx层，NaOH处理产生硅醇（Si–OH）基团，为硅烷化提供反应位点
- 硅烷化修饰层：3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）5%乙醇溶液处理，引入氨基（–NH2）并于150 °C固化
- 交联偶联层：2.5%戊二醛（glutaraldehyde）水溶液与APTMS氨基反应生成醛基，用于与蛋白氨基形成亚胺键
- 识别元件：IANBD标记的细胞色素P450 BM3血红素域（BMP，CYP102A1）以10 μM浓度固定于PS孔道内，特异性结合花生四烯酸（AA）
- 信号标记物：IANBD amide荧光探针（λabs 478 nm，λem 540 nm）共价连接于BMP Cys62，AA结合引起构象变化并增强荧光
- 读出系统：荧光显微镜（20×物镜）/光纤光谱仪（Ocean Optics USB 2000）与白光反射干涉测量（10×物镜），用于540 nm荧光和干涉条纹位移检测
中文摘要
本研究开发了一种基于细胞色素P450酶的花生四烯酸（AA）多孔硅生物传感器。作者提出一种新的换能方法，可在分析物与多孔硅表面固定酶结合时，同时测量折射率变化和荧光强度变化。将荧光探针连接于细胞色素P450 BM3血红素域（BMP）中血红素结构域变构位点的半胱氨酸残基上，当BMP与其底物花生四烯酸相互作用时，探针荧光强度增强。花生四烯酸参与阿尔茨海默病、肝癌和细胞炎症等过程。将BMP固定于多孔硅表面后，利用该换能方法成功构建了AA生物传感器，在10–200 μM动态范围内达到10 μM的检出限。同时监测折射率变化，其检出限为30 μM。在血浆中的初步测试证明，即使在50–100 μM范围内存在干扰物，传感器仍具有较高特异性和选择性。作者建议同时使用这两种检测系统，以提高传感器准确度和动态范围，并避免假阳性响应。
英文摘要
A porous silicon biosensor based on P450 enzyme for arachidonic acid detection was developed. A new transduction method is presented with a simultaneous measurement of refractive index and fluorescence intensity changes when the analyte is binding to an enzyme on the porous silicon surface. A fluorophore bound to a cysteine residue in an allosteric position of the haem domain (BMP) of cytochrome P450 BM3 enhances its fluorescence intensity upon interaction with its substrate arachidonic acid, involved in diseases such as Alzheimer's, liver cancer and cellular inflammation processes. BMP has been anchored on porous silicon surface and the new transduction method has been successfully exploited to develop a biosensor for arachidonic acid, reaching a detection limit of 10 μM arachidonic acid in a dynamic range of 10-200 μM. Moreover, the change of the refractive index has been also monitored at the same time, displaying a higher detection limit of 30 μM. Preliminary test were also conducted in plasma proving the high specificity and selectivity of the sensor even in presence of interferents in the range of 50-100 μM. Here we suggest these two detection systems could be used simultaneously to increase the accuracy and the dynamic range of the sensor avoiding a false positive response.