组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Aurora B 激酶介导的磷酸化（Aurora B-mediated phosphorylation；底物如 histone H3 Ser10、Dsn1 Ser100），样品基质：活细胞（HeLa、U2OS-LacO）
检测原理
该 FRET 磷酸化传感器由靶向域、Aurora B 底物肽、FHA2 磷酸苏氨酸结合域和 CFP/YFP（或 TFP/YFP）FRET 对组成。Aurora B 在着丝粒被局部富集，并通过 INCENP C 端 Thr-Ser-Ser 磷酸化激活；激活的激酶磷酸化传感器中的底物肽。FHA2 结合磷酸化肽后改变 FRET 对距离/取向，使 YFP/CFP 发射比下降，比值变化反映局部磷酸化水平。由于激酶从着丝粒释放并扩散，而细胞质磷酸酶使远处活性降低，形成以着丝粒为中心的空间磷酸化梯度。活细胞荧光显微镜同时采集 CFP/TFP 与 YFP 并计算比值，实现实时读出。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该研究未在体外样品中报告 LOD、线性范围或回收率，而是在活细胞中验证传感器响应。Borealin 或 INCENP 耗竭后，CBDBD-INCENP 可恢复着丝粒和染色质靶向传感器的磷酸化，而 TSS/AAA 突变体不能恢复外动粒和染色质底物磷酸化；CBDBD-INCENP 的 FRAP 约 2 min 恢复约 40%，比 CBFL-INCENP 快，且更有效恢复染色质传感器信号。0.3 µM ZM447439 部分抑制时出现以着丝粒为中心的磷酸化梯度，ZM 洗脱后磷酸化从着丝粒向染色体臂扩散。结果与 pH3 Ser10、pDsn1 Ser100 抗体及冷稳定微管实验一致，支持扩散梯度模型。
传感器的构成
- 表达/成像基底：活细胞（HeLa、U2OS-LacO）与多聚赖氨酸盖玻片，作为传感器表达和活细胞成像基质，无电极。
- 靶向定位层：N端靶向域（CBDBD/CBFL 融合至着丝粒、H2B 融合至染色质、Hec1 N端融合至外动粒），将 FRET 传感器定位到指定细胞区室。
- 识别元件：FHA2 磷酸苏氨酸结合域（FHA2 phospho-Thr-binding domain），识别并结合同一传感器内被 Aurora B 磷酸化的底物肽。
- 底物/识别桥：Aurora B 底物肽（substrate peptide），位于 FRET 对与 FHA2 之间，接受 Aurora B 磷酸化。
- 信号换能元件：CFP/YFP 或 TFP/YFP FRET 对，磷酸化引起 FHA2 结合和构象变化，改变 YFP/CFP 发射比。
- 辅助定位标记：CB-mCherry 或 CBDBD-INCENP-mCherry，标记着丝粒或 INCENP，用于共定位、FRAP 和线扫描分析。
中文摘要
Aurora B 激酶对细胞分裂成功至关重要，并调控纺锤体组装和动粒-微管相互作用。该激酶在有丝分裂后期前定位于内着丝粒，但其许多底物具有不同定位，例如染色体臂和动粒。此外，底物磷酸化依赖于与激酶的距离。激酶如何到达远处底物以及空间磷酸化模式如何确定尚不清楚。本文表明，磷酸化梯度由 Aurora B 在着丝粒的富集与激活、以及释放和扩散到达远处底物产生。激酶在着丝粒或其他染色体位点的富集对全局活性都是必需的。通过实验操控着丝粒动态交换，我们证明激酶通过扩散到达底物。我们还利用荧光共振能量转移（FRET）生物传感器直接观察到激酶激活后磷酸化从着丝粒扩散。我们提出，Aurora B 在着丝粒的动态与从内着丝粒的扩散产生空间信息，从而调控细胞分裂。
英文摘要
Aurora B kinase is essential for successful cell division and regulates spindle assembly and kinetochore-microtubule interactions. The kinase localizes to the inner centromere until anaphase, but many of its substrates have distinct localizations, for example on chromosome arms and at kinetochores. Furthermore, substrate phosphorylation depends on distance from the kinase. How the kinase reaches substrates at a distance and how spatial phosphorylation patterns are determined are unknown. In this paper, we show that a phosphorylation gradient is produced by Aurora B concentration and activation at centromeres and release and diffusion to reach substrates at a distance. Kinase concentration, either at centromeres or at another chromosomal site, is necessary for activity globally. By experimentally manipulating dynamic exchange at centromeres, we demonstrate that the kinase reaches its substrates by diffusion. We also directly observe, using a fluorescence resonance energy transfer-based biosensor, phosphorylation spreading from centromeres after kinase activation. We propose that Aurora B dynamics and diffusion from the inner centromere create spatial information to regulate cell division.