组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
细菌鞭毛肽 flg22、细菌 EF-Tu 肽 elf18、真菌几丁质 chitin 诱导的胞内 Ca2+（样品基质：转基因拟南芥 35S::aequorin 幼苗/96孔培养液）
检测原理
MAMP（flg22、elf18、chitin）被拟南芥细胞表面模式识别受体 PRR（FLS2、EFR、CERK1）识别后，通过尚不明确的机制激活谷氨酸依赖的 iGluR 样通道，使质外体 Ca2+ 经质膜通道内流，形成胞质钙瞬变。稳定表达的 aequorin 与 Ca2+ 结合后构象改变，催化 coelenterazine 发生化学发光；发光强度随胞内 Ca2+ 浓度升高而增强，由 96 孔光度计时间分辨记录并换算为 Δ[Ca2+]。药理学抑制剂或 L-谷氨酸脱敏可降低通道开放，从而降低钙信号；LaCl3 或 EGTA 阻断质外体 Ca2+ 则完全抑制瞬变。下游 MAPK/CDPK 激活和防御基因转录作为功能读出。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
实验采用 4–6 个孔平均、至少 3 次生物学重复，统计显著性 P<0.05。LaCl3 和 EGTA 完全抑制三种 MAMP 诱导的钙瞬变，证明主要钙源为质外体。AP-5、AP-7 和 kynurenic acid 显著降低 flg22、elf18、chitin 诱导的 Δ[Ca2+]，而 MK-801、DNQX、CNQX 基本不影响；L-谷氨酸和 L-天冬氨酸可脱敏钙响应，0.2 mM 起效，>0.6 mM 达到最大抑制，基础 Ca2+ 升至 125–158%。iGluR 调节还延迟或降低 MAPK 激活，并抑制 FRK1 转录、改变 PHI-1 基础表达。作者据此主张 iGluR 样通道介导 MAMP 触发的植物免疫钙内流。
传感器的构成
- 生物传感器载体：转基因拟南芥 35S::aequorin 幼苗，稳定表达 aequorin，用于胞质/核 Ca2+ 监测
- 换能器/信号蛋白：aequorin（荧光素酶，约22 kDa），结合 Ca2+ 后催化 coelenterazine 发光
- 化学发光底物：coelenterazine（10 μM），与 aequorin-Ca2+ 反应产生光信号
- 识别元件：PRR（FLS2、EFR、CERK1），分别识别 flg22、elf18、chitin
- 信号通道：iGluR-like channels（AtGLR/AtiGluR），介导质外体 Ca2+ 内流
- 药理学调节剂：LaCl3、EGTA、AP-5、kynurenic acid、L-glutamate 等，用于阻断或脱敏 Ca2+ 通道
- 读出装置：Berthold Centro LB960 光度计，96 孔板时间分辨发光检测
中文摘要
微生物相关分子模式（MAMP）与模式识别受体（PRR）结合并激活受体激酶是植物先天免疫的关键步骤。MAMP 感知后最早可检测事件之一是胞质 Ca2+ 水平快速短暂升高。植物中导致 Ca2+ 内流的信号事件及所涉通道分子身份知之甚少。本研究使用稳定表达荧光素酶 aequorin Ca2+ 生物传感器的转基因拟南芥，监测细菌肽 MAMP flg22、elf18 和真菌碳水化合物 MAMP 几丁质处理后钙信号，并用一系列已知可干扰植物和动物 Ca2+ 转运过程的化合物进行药理学干预。结果发现氨基酸调控的 Ca2+ 通量，可能通过离子型谷氨酸受体（iGluR）样通道，在 MAMP 触发的钙内流中起突出作用。干扰氨基酸介导的 Ca2+ 通量会调节 MAMP 触发的 MAPK 活性，并影响 MAMP 诱导的防御基因转录积累。作者结论：flg22、elf18 和几丁质识别启动先天免疫反应涉及通过 iGluR 样通道的质外体 Ca2+ 内流。
英文摘要
Binding of specific microbial epitopes [MAMPs (microbe-associated molecular patterns)] to PRRs (pattern recognition receptors) and subsequent receptor kinase activation are key steps in plant innate immunity. One of the earliest detectable events after MAMP perception is a rapid and transient rise in cytosolic Ca2+ levels. In plants, knowledge about the signalling events leading to Ca2+ influx and on the molecular identity of the channels involved is scarce. We used a transgenic Arabidopsis thaliana line stably expressing the luminescent aequorin Ca2+ biosensor to monitor pharmacological interference with Ca2+ signatures following treatment with the bacterial peptide MAMPs flg22 and elf18, and the fungal carbohydrate MAMP chitin. Using a comprehensive set of compounds known to impede Ca2+-transport processes in plants and animals we found strong evidence for a prominent role of amino acid-controlled Ca2+ fluxes, probably through iGluR (ionotropic glutamate receptor)-like channels. Interference with amino acid-mediated Ca2+ fluxes modulates MAMP-triggered MAPK (mitogen-activated protein kinase) activity and affects MAMP-induced accumulation of defence gene transcripts. We conclude that the initiation of innate immune responses upon flg22, elf18 and chitin recognition involves apoplastic Ca2+ influx via iGluR-like channels.