组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
基质金属蛋白酶-9（MMP-9）胶原酶活性、MMP-9催化域（MMP-9 CAT）胶原酶活性；样品基质：Tris缓冲液或Tris–NaCl–Brij缓冲液
检测原理
胶原IV经SPDP活化后，通过二硫键固定于半胱胺修饰的CM5芯片表面，形成稳定的天然三螺旋底物层。溶液中的MMP-9或MMP-9催化域与表面胶原IV结合，其催化域水解胶原肽键，使固定化胶原IV被切割并从表面脱落或质量减少。SPR换能器将表面质量变化转换为响应单位（RU）变化，胶原酶活性越强，ΔRU随时间下降越快、幅度越大。通过不同MMP-9浓度下的时间曲线，按Langmuir吸附与Michaelis–Menten表面酶动力学模型拟合，可得到ka、kd和kcat。NaCl和Brij-35主要抑制非特异吸附，但会降低MMP-9与胶原IV的结合亲和力。该方法无外源信号放大，直接依赖表面质量变化。
检测灵敏度
LOD: 4.9 ng/ml（Tris–NaCl–Brij，MMP-9）；LOD: 7 × 10−2 ng/ml（Tris，MMP-9）；LOD: 6.0 ng/ml（Tris，MMP-9 CAT）；线性范围: 100–400 ng/ml（MMP-9 CAT）；响应浓度范围: 25–100 ng/ml（MMP-9，Tris–NaCl–Brij）、0.25–5 ng/ml（MMP-9，Tris）
效应效果
该SPR方法可实时监测MMP-9对天然三螺旋胶原IV的水解，EDTA存在时无明显信号下降，表明信号源于胶原酶活性。加入NaCl和Brij-35可将100 ng/ml MMP-9在cysteamine芯片上的非特异吸附由660±120 RU降至8±4 RU，但会降低MMP-9与胶原IV的结合亲和力。胶原IV芯片经TCEP还原二硫键后可重复固定，三次响应相近。MMP-9在Tris中检测限为7×10−2 ng/ml，比Tris–NaCl–Brij中的4.9 ng/ml高约两个数量级；MMP-9 CAT检测限为6.0 ng/ml。与SDS–PAGE和FRET均相法相比，SPR无需变性/复性，可直接获得表面酶动力学参数，适用于其他MMP。
传感器的构成
- 基底/换能器：金膜玻璃片（gold-coated glass）与CM5芯片（carboxymethylated dextran），提供SPR换能表面和羧基官能团
- 活化层：EDC/NHS（1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺）活化CM5羧基，形成可偶联基团
- 修饰层：cysteamine（半胱胺）与活化羧基反应，形成含游离硫醇的表面，用于二硫键固定
- 识别/底物层：SPDP–collagen IV（N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸活化胶原IV）通过二硫键固定，作为MMP-9天然三螺旋底物
- 平衡/反应介质：HBS–EP（含0.005% Tween 20）用于芯片平衡；Tris或Tris–NaCl–Brij缓冲液用于MMP-9反应，EDTA作抑制剂对照
- 再生试剂：TCEP（tris(2-carboxyethyl)phosphine）还原二硫键，使胶原IV芯片可再生重复使用
中文摘要
本文报道了一种利用表面等离子共振（SPR）生物传感器实时监测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对天然三螺旋胶原IV胶原酶活性的简便方法。将SPDP活化的胶原IV通过二硫键固定于半胱胺修饰的CM5传感器芯片表面，MMP-9从溶液相与固定化胶原IV结合并催化其水解，导致传感器表面质量减少，SPR响应单位随时间下降。通过监测SPR信号变化，可实时反映MMP-9的胶原酶活性，并依据表面酶动力学模型估算全长MMP-9及其催化域的催化常数（kcat）、结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd）。反应液中加入NaCl和非离子去污剂Brij-35会降低MMP-9的胶原酶活性，但能显著抑制MMP-9与半胱胺修饰芯片之间的非特异性相互作用。全长MMP-9与催化域的动力学参数比较表明，全长MMP-9的结合常数显著高于催化域，提示血红素结合样结构域、纤连蛋白II型重复基序和连接区（O-糖基化结构域）协同参与胶原IV识别。
英文摘要
We describe a simple method for real-time monitoring of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) collagenolytic activity for native triple helical collagen IV with a surface plasmon resonance (SPR) biosensor. The proteolytic activity of MMP-9 is measured as a decrease in the SPR signal resulting from the cleavage of collagen IV immobilized on the sensor surface. The kinetic parameters of full-length MMP-9 and its catalytic domain-catalytic constant (k(cat)), association rate constant (k(a)), and dissociation rate constant (k(d))-were estimated by the SPR method. The presence of sodium chloride and a nonionic detergent Brij-35 in a reaction solution led to the lower collagenolytic activity of MMP-9, whereas they suppressed the nonspecific interaction between MMP-9 and a cysteamine-modified chip. The comparison of kinetic parameters between MMP-9 and its catalytic domain revealed that the association constant of MMP-9 is much larger than that of the catalytic domain, suggesting that the interplay among hemopexin-like domain, fibronectin type II repeats motif, and linker region (O-glycosylated domain) plays an important role in recognizing collagen IV.