组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）；样品基质：10 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）
检测原理
H2O2扩散进入明胶B水凝胶，与包埋的CCP活性中心结合，CCP血红素被H2O2氧化形成过氧化物酶中间体，并将H2O2还原为水；该催化过程需要两个还原态HHC作为电子供体。HHC在凝胶中保持可移动，接受CCP传递的电子后扩散至金电极表面，在电极上发生氧化，将电子传回电极。由于HHC作为可移动介体，CCP催化H2O2还原的法拉第电流与H2O2浓度相关：低浓度下稳态还原电流随[H2O2]线性增加，高浓度下受酶动力学限制趋于饱和，符合Michaelis–Menten机制。金电极经6-MH修饰降低非特异H2O2还原，提高选择性。电位计记录循环伏安S形波和稳态电流，实现H2O2定量。
检测灵敏度
LOD: 1×10−5 M；线性范围: 0–0.3 mM；R = 0.987
效应效果
该传感器响应迅速，线性范围扩展至0–0.3 mM，检出限1×10−5 M，最大稳态电流1.4 mA，表观KM 0.3689 mM。选择性来自酶对H2O2的底物特异性、低过电位以及6-MH修饰降低金电极非特异催化活性。稳定性方面，在4.6 mM H2O2中连续循环伏安时，第20至30圈限制电流逐渐下降，推测HHC被H2O2攻击；但该浓度比线性范围高一个数量级，属于加速耐久性测试。文中未报告RSD与实际样品回收率。凝胶包埋未观察到蛋白泄漏，从第1圈即获得稳定电化学信号。作者认为该无膜明胶包埋策略可增强酶稳定性、抗脱水/复水能力，并适用于工业生物传感器开发。
传感器的构成
- 工作电极基底：金电极（Au），机械抛光，提供电子传导与电化学换能。
- 表面修饰层：6-巯基己醇（6-MH）自组装单层（SAM），修饰Au表面，降低非特异H2O2还原并稳定明胶界面。
- 水凝胶包埋层：B型明胶（GelB）水凝胶，5 wt%溶液滴涂干燥，形成亲水三维网络，包埋并稳定蛋白。
- 催化识别元件：酿酒酵母细胞色素c过氧化物酶（CCP，C128A），催化H2O2还原，提供底物特异性。
- 电子介体：马心脏细胞色素c（HHC），在凝胶中可移动，介导CCP与电极间电子传递。
中文摘要
本文报道一种基于无膜酶电极的新型通用方法，将酶和介导蛋白共同包埋于明胶水凝胶中用于生物传感器制备。作为原理验证，作者将马心脏细胞色素c（HHC）和酿酒酵母细胞色素c过氧化物酶（CCP）包埋于明胶基质中，并固定于经6-巯基己醇（MH）自组装单层修饰的金电极表面，构建过氧化氢生物传感器。明胶B水凝胶提供亲水、生物相容的微环境，通过静电作用和尺寸限制稳定HHC与CCP，同时允许底物、酶和介体扩散。循环伏安和稳态电流测试表明，只有HHC和CCP同时存在时，电极对H2O2表现出可逆S形电催化还原波；HHC作为电子介体将CCP催化还原H2O2产生的电子传递至金电极。该传感器在10 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中响应迅速，线性范围为0–0.3 mM，相关系数R=0.987，检出限为1×10−5 M，并符合Michaelis–Menten动力学，表观Km为0.3689 mM。该包埋策略有望用于工业生物传感器开发。
英文摘要
A novel and versatile method, based on a membrane-free enzyme electrode in which both the enzyme and a mediator protein are entrapped in a gelatine hydrogel was developed for the fabrication of biosensors. As a proof of principle, we prepared a hydrogen peroxide biosensor by successfully entrapping both horse heart cytochrome c (HHC) and Saccharomyces cerevisae cytochrome c peroxidase (CCP) in a gelatin matrix which is immobilized on a gold electrode. This electrode was first pretreated with 6-mercaptohexanol. The biosensor displayed a rapid response and an expanded linear response range from 0 to 0.3 mM (R = 0.987) with a detection limit of 1 × 10(-5)M in a HEPES buffer solution (pH 7.0). This method of encapsulation is now further investigated for industrial biosensor applications.