组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞内可交换锌/自由锌（intracellular exchangeable zinc / free Zn2+）；样品基质：大肠杆菌 BL21(DE3) 胞内（MOPS 最小培养基）
检测原理
传感器由 CAII 与 C 端 RFP 融合构成。胞内可交换 Zn2+ 与 CAII 活性位点结合形成 holo-CA，使芳基磺酰胺抑制剂 DPS 选择性结合；DPS 结合后量子产率显著升高并在 530 nm 发射，作为 FRET 供体。350 nm 激发下，DPS 的发射通过 FRET 转移至 TagRFP，产生 620 nm FRET 通道信号；直接激发 RFP 的 FP 通道反映传感器总量。IFRET/IFP 比值随 CA 锌结合分数增加而升高，呈双曲线依赖，可用 NTA 锌缓冲液建立的体外/原位校准曲线换算自由锌浓度。该设计以 FRET 比率消除传感器浓度影响，并利用 DPS 结合 holo-CA 的荧光增强实现信号放大。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
传感器对锌选择性高，CAII 不受 μM Fe2+ 或 mM Ca2+/Mg2+ 干扰；DPS 信号可被 ethoxzolamide 竞争抑制，IFRET/IFP 回到 0.19±0.03。TPEN 使比值降至 0.19±0.04，digitonin+ZnSO4 升至约 0.8。单细胞像素标准差小于 5%；约 80% 细胞自由锌为 10–30 pM，中位 20 pM。wt、Q92A、T199A 给出 15–40 pM，占有率 46±8%、74±5%、64±8%。信号变化 3.5–4.5 倍，大于 CA_AF594 的 50% 和 eCALWY 的 2 倍。锌冲击后 20 min 升至 35–40 nM，后降至 1000 pM，可研究原核金属稳态。
传感器的构成
- 表达基质：大肠杆菌 BL21(DE3) 胞质（MOPS 最小培养基），提供传感器表达与胞内锌检测环境。
- 识别元件：人碳酸酐酶 II (CAII) 及其突变体（wt、Q92A、E117A、T199A、H94N），结合胞内 Zn2+，决定传感器亲和力与选择性。
- 信号受体/内源标记：C端融合红色荧光蛋白 (RFP)，优选 TagRFP，另测 DsRed2、mCherry，作为 FRET 受体并指示传感器总浓度。
- 连接层：CA 与 RFP 间 1 或 3 个甘氨酸 linker，调节融合蛋白构象与表观锌亲和力。
- 信号标记物：dapoxyl sulfonamide (DPS)，选择性结合含锌 CA，结合后荧光量子产率升高，530 nm 发射作为 FRET 供体。
- 表达/纯化元件：pET24a 表达载体与 C 端 6×His 标签，用于大肠杆菌 BL21(DE3) 表达和 Ni-NTA 亲和纯化。
- 换能/读出系统：倒置荧光显微镜、FRET 通道 Ex 350/Em 620 与 FP 通道 Ex 530/Em 620 滤片组、CCD 相机，输出 IFRET/IFP 荧光比。
中文摘要
锌是多种细胞过程所必需的微量元素，其稳态在生物体内受到严格调控。荧光传感器已成为监测活细胞中可交换锌浓度的重要工具。一类生物传感器以碳酸酐酶（CA）为识别元件，利用其可调亲和力、优异金属选择性以及芳基磺酰胺配体结合锌后产生的荧光信号。本研究将碳酸酐酶与红色荧光蛋白融合，构建了一系列基因编码的基于 Förster 共振能量转移（FRET）的激发比率锌传感器。这些传感器对生理自由锌浓度变化表现出显著信号增强，并被应用于原核模式生物大肠杆菌，以定量其胞内可交换锌浓度。在最小培养基中，表达 CA 传感器的大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞胞内可交换锌中位浓度为 20 pM，远低于约 0.2 mM 的细胞总锌浓度。此外，胞内可交换锌浓度随环境锌浓度变化而变化。
英文摘要
Zinc is an essential element for numerous cellular processes, therefore zinc homeostasis is regulated in living organisms. Fluorescent sensors have been developed as important tools to monitor the concentrations of readily exchangeable zinc in live cells. One type of biosensor uses carbonic anhydrase (CA) as the recognition element based on its tunable affinity, superior metal selectivity, and fluorescence signal from aryl sulfonamide ligands coupled to zinc binding. Here, we fuse carbonic anhydrase with a red fluorescent protein to create a series of genetically-encoded Förster resonance energy transfer-based excitation ratiometric zinc sensors that exhibit large signal increases in response to alterations in physiological-free zinc concentrations. These sensors were applied to the prokaryotic model organism Escherichia coli to quantify the readily exchangeable zinc concentration. In minimal media, E. coli BL21(DE3) cells expressing the CA sensor, exhibit a median intracellular readily exchangeable zinc concentration of 20 pM, much less than the total cellular zinc concentration of ∼0.2 mM. Furthermore, the intracellular readily exchangeable zinc concentration varies with the concentration of environmental zinc.