组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）；样品基质：原代成年小鼠心肌细胞（细胞内培养体系）
检测原理
本文使用两种荧光传感体系检测心肌细胞内 NO 和 H2O2。NO 检测采用 Cu2(FL2E) 化学探针：探针进入细胞后被酯酶水解为 Cu2(FL2A)，NO 与 Cu(II) 中心发生特异性反应，改变探针电子结构并引起 470 nm 激发下荧光增强；荧光增强速率或幅度随细胞内 NO 生成增加而升高，且 H2O2 存在时仍可检测 NO。H2O2 检测采用基因编码荧光生物传感器 HyPer2：H2O2 氧化 HyPer2 的敏感位点，改变其 YFP 荧光特性，通过 500 nm 与 420 nm 激发下的 YFP 发射比率（YFP500/YFP420）定量 H2O2，比率随 H2O2 浓度升高而增大。两种信号均由倒置显微镜或共聚焦显微镜采集，实现细胞内动态成像。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
研究未报告 LOD、线性范围、RSD 或回收率，但提供选择性与机制验证。Cu2(FL2E) 对 NO 特异，H2O2 存在下仍可检测 NO；HyPer2 对 H2O2 特异，Ang-II（500 nM）和 H2O2（10 μM）升高荧光比率，ISO（100 nM）不升高。PEG-catalase（100 units/mL）清除 H2O2 后阻断 Ang-II 诱导的 eNOS Ser1177/Ser633 磷酸化、NO 合成和收缩增强，但不影响 ISO。eNOS 敲除消除 H2O2/Ang-II 诱导的 NO 合成，nNOS 敲除显著减弱 ISO 诱导的 NO 合成。数据来自至少三次独立实验，均值±标准误，p<0.05、p<0.01 或 p<0.001 显著。作者认为结果确立 H2O2 在 Ang-II 信号、eNOS 激活和心肌收缩中的差异作用，为氧化应激调控 NO 信号提供新靶点。
传感器的构成
- 细胞培养基底：玻璃盖玻片/玻璃底培养皿（coverslips/glass bottom dishes），承载原代心肌细胞并用于倒置显微镜或共聚焦成像。
- 传感载体细胞：原代成年小鼠心肌细胞（cardiac myocytes），表达 eNOS/nNOS 并可被慢病毒转染表达 HyPer2。
- NO 识别探针：Cu2(FL2E)（NO chemical sensor），细胞内酯酶水解为 Cu2(FL2A)，与 NO 反应后荧光增强。
- H2O2 识别元件：HyPer2（H2O2 biosensor），基因编码荧光蛋白，经慢病毒表达于心肌细胞，H2O2 氧化后改变 YFP 荧光比率。
- 信号标记物：荧光信号（fluorescence intensity/ratio），Cu2(FL2A) 470 nm 激发荧光增强；HyPer2 YFP500/YFP420 激发比率。
- 光学读出装置：倒置显微镜/共聚焦显微镜（Olympus IX81/DSU spinning disk）与 Hamamatsu Orca CCD 相机，采集荧光时间曲线。
- 干扰验证试剂：PEG-catalase（PEG-过氧化氢酶），进入细胞将 H2O2 转化为 H2O 和 O2，用于验证 H2O2 依赖信号。
中文摘要
一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）均在心肌细胞内合成，并参与心血管信号调节。心肌细胞同时表达内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和神经型一氧化氮合酶（nNOS），但两种酶在心肌信号中的差异作用以及活性氧与活性氮物种之间的互作仍不清楚。作者利用新开发的 NO 化学传感器 Cu2(FL2E) 检测野生型、eNOS 敲除和 nNOS 敲除小鼠的原代成年心肌细胞，发现生理浓度 H2O2 可激活 eNOS 但不激活 nNOS。H2O2 诱导的 eNOS 激活依赖 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）和蛋白激酶 B（Akt）的磷酸化，并导致 eNOS 在 Ser1177 和 Ser633 位点发生强磷酸化。利用表达 H2O2 生物传感器 HyPer2 的慢病毒感染小鼠后，作者发现血管紧张素 II（Ang-II）刺激可诱导心肌细胞产生明显 H2O2，而 β 肾上腺素能受体激活则不产生 H2O2。Ang-II 促进心肌收缩力的作用依赖 H2O2，而 β 肾上腺素能收缩反应独立于 H2O2 信号。研究揭示了 H2O2 在心肌收缩力和受体依赖性 NOS 激活中的差异作用，并指出氧化应激调控 NO 信号的新位点。
英文摘要
Nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H(2)O(2)) are synthesized within cardiac myocytes and play key roles in modulating cardiovascular signaling. Cardiac myocytes contain both the endothelial (eNOS) and neuronal (nNOS) NO synthases, but the differential roles of these NOS isoforms and the interplay of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in cardiac signaling pathways are poorly understood. Using a recently developed NO chemical sensor [Cu(2)(FL2E)] to study adult cardiac myocytes from wild-type, eNOS(null), and nNOS(null) mice, we discovered that physiological concentrations of H(2)O(2) activate eNOS but not nNOS. H(2)O(2)-stimulated eNOS activation depends on phosphorylation of both the AMP-activated protein kinase and kinase Akt, and leads to the robust phosphorylation of eNOS. Cardiac myocytes isolated from mice infected with lentivirus expressing the recently developed H(2)O(2) biosensor HyPer2 show marked H(2)O(2) synthesis when stimulated by angiotensin II, but not following β-adrenergic receptor activation. We discovered that the angiotensin-II-promoted increase in cardiac myocyte contractility is dependent on H(2)O(2), whereas β-adrenergic contractile responses occur independently of H(2)O(2) signaling. These studies establish differential roles for H(2)O(2) in control of cardiac contractility and receptor-dependent NOS activation in the heart, and they identify new points for modulation of NO signaling responses by oxidant stress.