组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
腺苷（adenosine, A）；样品基质：结合缓冲液（binding buffer）、人血清（human serum，PBS 10倍稀释）
检测原理
该传感器以玻璃片为固相基底，经 APTES 和戊二醛活化后，将 5′-氨基腺苷适配体共价固定于表面。ETN 标记的 ssDNA 与适配体部分互补杂交，形成 aptamer/ssDNA 双链，ETN 作为长寿命荧光标记物。加入腺苷后，适配体优先与腺苷结合形成更稳定的 aptamer/target 复合物，发生结构切换，使 ETN-ssDNA 从界面解离并被洗脱。采用时间分辨荧光模式（延迟 0.1 ms、门宽 1.0 ms）消除短寿命背景，在 360 nm 激发、611 nm 发射下监测 ETN 荧光。腺苷浓度越高，界面 ETN-ssDNA 释放越多，荧光强度下降越大，ΔF 与腺苷浓度成正比。
检测灵敏度
LOD: 5.61 nM；线性范围: 1.0 × 10−8 M–1.0 × 10−7 M；校准方程: y = −0.3853x + 67.8789；斜率: −0.3853；R^2 = 0.9761
效应效果
选择性方面，500 nM 腺苷、胞苷和尿苷处理后，时间分辨荧光强度分别为 12.57、67.70 和 60.78，缓冲液为 72.33，表明腺苷可被明确识别；鸟苷因室温溶解度差未测。重现性方面，0–1000 nM 腺苷三次独立测量 RSD 为 2.5%–12.0%。实际样品中，人血清经 PBS 10 倍稀释后加标 25、75、250 和 1000 nM 腺苷，回收率分别为 90%、90%、92% 和 112%，RSD 为 4.1%、6.9%、8.8% 和 9.5%，说明传感器可在复杂血清基质中工作。作者认为该方法操作简便、材料用量低、成本低，适用于适配体法小分子检测。
传感器的构成
- 基底：玻璃片（glass slide），作为固相载体与光学检测基底
- 硅烷化修饰层：3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES），在玻璃表面引入氨基
- 醛基活化层：戊二醛（glutaraldehyde），与 APTES 氨基反应形成醛基表面
- 识别元件：5′-氨基修饰腺苷适配体（AptAdo），通过共价键固定并特异性识别腺苷
- 封闭/还原层：甘氨酸（glycine）封闭未反应醛基，氰基硼氢化钠（NaBH3CN）还原亚胺键
- 信号探针：ETN 标记 ssDNA（ETN-ssDNA），与适配体部分互补杂交并提供荧光信号
- 信号标记物：自制铕配合物 Eu(TTA)3(5-NH2-phen)（ETN），提供长寿命时间分辨荧光
中文摘要
本文报道了一种基于自制铕配合物的时间分辨荧光生物传感器，用于小分子的高灵敏检测，并以腺苷为模型分析物。该传感器采用自制铕配合物 Eu(TTA)3(5-NH2-phen)（ETN）作为荧光标记物，其荧光信号可通过时间分辨方式测量，从而消除大部分非特异性荧光背景。5′-氨基修饰的腺苷适配体探针通过共价键固定在醛基修饰的玻璃片表面；与适配体部分互补的短链 ssDNA 标记 ETN 后，通过杂交反应固定在玻璃片上。加入腺苷后，适配体优先与腺苷结合，诱导适配体/ssDNA 双链向适配体/靶标复合物结构切换，使 ETN 标记 ssDNA 从传感界面解离，导致时间分辨荧光强度下降。荧光强度下降值与腺苷量成正比。在优化条件下，线性范围为 1.0×10−8 M 至 1.0×10−7 M，检出限为 5.61 nM。该传感器具有优异选择性，为适配体法检测腺苷提供了潜在应用。
英文摘要
In this protocol, the authors report a time-resolved fluorescence biosensor based on home-made europium complexes for highly sensitive detection of small molecules using adenosine as a model analyte. The fluorophore that used is europium complexes. Its signal can be measured in a time-resolved manner that eliminates most of the unspecific fluorescent background. The amino modified aptamer probe, which is designed to specifically recognize adenosine, is combined to the aldehyde-group modified glass slide by covalent bond. Europium complex-labeled a short ssDNA, designed to segment hybridize with aptamer probe is immobilized on the glass slide by hybridization reaction. In the presence of adenosine, the aptamer part is more inclined to bounds with adenosine and triggers structure-switching of the aptamer from aptamer/ssDNA duplex to aptamer/target complex. As a result, europium complexes-labeled ssDNA is forced to dissociate from the sensor interface, resulting in time-resolved fluorescence intensity decrease. The decrement intensity is proportional to the amount of adenosine. Under optimized assay conditions, a linear range (1.0×10(-8)M to 1.0×10(-7)M) is got with low detection limit of 5.61nM. The biosensor exhibits excellent selectivity and can provide a promising potential for aptamer-based adenosine detection.