组成图示
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传感器类型
电化学发光(ECL)生物传感器
检测对象
单核苷酸多态性（SNP，single-nucleotide polymorphism）/一碱基突变DNA（mDNA，mutant DNA），样品基质为构建DNA混合溶液（突变型与野生型DNA混合）
检测原理
CdS NCs薄膜在负电位下被还原为CdS•−，与S2O8^2-产生的SO4•−反应生成激发态CdS*并发出ECL。初始三茎探针中，Au NPs和CdTe NPs靠近CdS NCs，分别通过ECL能量转移和能量捕获猝灭发光，背景低。当完全互补mDNA进入，置换CdTe NPs标记的第三茎并与双茎探针杂交，三茎结构打开，CdTe NPs离开，Au NPs远离薄膜；Au NPs的ECL诱导表面等离子共振（SPR）反向增强CdS NCs发光，ECL上升。随后引物、Klenow聚合酶、Nb.BbvCI切口内切酶和dNTPs在25℃等温循环中，以探针为模板进行链置换合成，NEase切割产生新起点，循环释放mDNA触发子，激活更多三茎探针，使ECL进一步放大。mDNA浓度越高，被激活探针和SPR增强越多，ΔI越大。
检测灵敏度
LOD: 35 aM（3σ）；线性范围: 0.4 fM–10 fM；动态范围: 0.4 fM–100 fM；回归方程: ΔI = 272.519C + 48.937（C为mDNA浓度，fM）；R = 0.9969；无等温循环对照LOD: 380 aM
效应效果
传感器通过双重猝灭降低背景：Au NPs修饰后ECL峰高下降42%，形成三茎探针后下降95%；加入mDNA后ECL较组装前增强94%，等温循环后较组装前增强约2倍。选择性方面，在突变型与野生型DNA总浓度10 fM的混合样品中，ECL随mDNA比例增加而增加；当mDNA仅占4%（0.4 fM）时仍出现明显ECL上升，表明可检测大量野生型背景中的痕量突变。与无等温循环对照相比，LOD由380 aM降至35 aM。原文未报告RSD、长期稳定性、实际生物样品回收率及与ELISA/qPCR等方法的直接对比。作者认为该策略简单、高选择、高灵敏，可用于SNP发现与分析、基础和临床诊断。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻碳电极（GCE），经氧化铝抛光，作为工作电极和ECL换能器。
- ECL发光层：CdS纳米晶（NCs）薄膜，滴涂于GCE，作为ECL发光体，与S2O8^2-共反应剂产生激发态发光。
- 连接/活化层：3-巯基丙酸（MPA）自组装于CdS NCs，提供羧基；EDC/NHS活化羧基用于连接DNA/Au NPs复合体。
- 识别元件1：双茎DNA探针标记Au NPs（bbc-ds-DNA-Au NPs，probe 1），自杂交形成双茎，与mDNA互补，并携带Au NPs猝灭/增强标记。
- 识别元件2：DNA探针标记CdTe NPs（CdTe-DNA-BSA，probe 2），与双茎探针杂交形成三茎探针，CdTe NPs作为ECL猝灭剂。
- 信号标记物：Au NPs和CdTe NPs，分别通过ECL能量转移/SPR增强和能量捕获猝灭CdS NCs发光。
- 封闭剂：BSA封闭CdS NCs和CdTe NPs上的非特异性结合位点。
- 信号放大元件：引物、Klenow片段外切酶缺失聚合酶（polymerase Klenow fragment exo-）、Nb.BbvCI切口内切酶（NEase）和dNTPs，组成等温循环DNA机器。
- 检测介质：PBS含K2S2O8，作为ECL共反应剂，用于产生ECL信号。
中文摘要
本文报道一种基于等温循环辅助三茎探针并标记金纳米粒子和碲化镉纳米粒子的电化学发光（ECL）单核苷酸多态性（SNP）检测方法。该体系以玻碳电极（GCE）上CdS纳米晶（NCs）薄膜作为ECL发光体，表面连接标记Au NPs的双茎DNA探针；随后标记CdTe NPs的第三茎与双茎DNA杂交形成三茎探针，使两种纳米标记物靠近CdS NCs薄膜。由于CdS NCs向Au NPs和CdTe NPs的能量转移，CdS NCs薄膜的ECL被双重猝灭，传感器背景较低。当作为SNP分析目标的一碱基突变DNA（mDNA）置换第三茎并与双茎探针杂交，使Au NPs远离CdS NCs薄膜时，观察到由Au NPs的ECL诱导表面等离子共振（SPR）引起的ECL增强。进一步，在引物、聚合酶和切口内切酶（NEase）诱导的等温循环后，ECL信号获得进一步放大。借助等温循环放大体系和三茎探针结构对特定靶序列的高选择性，该生物传感器表现出优异的SNP分辨能力，具有高选择性和低检出限（35 aM）。
英文摘要
We report here a new electrochemiluminescence (ECL) approach for detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) based on isothermal cycle-assisted triple-stem probe labeled with Au nanoparticles (NPs) and CdTe NPs. The system is composed of a CdS nanocrystals (NCs) film on glassy carbon electrode (GCE) as ECL emitter attached a double-stem DNA probe labeled with Au NPs. Then, the third stem labeled with CdTe NPs hybridizes with the double-stem DNA to form a triple-stem probe with the two labels near the CdS NCs film. A dual-quenched ECL of CdS NCs film is achieved due to energy transfer (ET) from CdS NCs to Au NPs and CdTe NPs, which makes the sensor exhibit relatively low background. Once the one base mutant DNA (mDNA) sequence as target of SNPs analysis displaces the third stem and hybridizes with the double-stem probe, forcing Au NPs away from the CdS NCs film, an ECL enhancement by the ECL-induced surface plasmon resonance of Au NPs is observed. Furthermore, after an isothermal cycle induced by primer, polymerase, and nicking endonuclease (NEase), a further enhancement of ECL is obtained. Taking advantages of the isothermal circular amplification system and the triple-stem probe architecture which enables turning its high selectivity toward specific target sequences, the reported biosensor shows excellent discrimination capabilities of SNPs with high selectivity and low detection limit (35 aM).