组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
环磷酸腺苷（cAMP, cyclic adenosine monophosphate）；样品基质：活细胞胞质（HEK293等哺乳动物细胞）及体外兔网织红细胞裂解液
检测原理
22F为基因编码融合蛋白，由PKA RIIβB cAMP结合域、N端连接肽和环状排列的Photinus pyralis荧光素酶组成。当GPCR激活使腺苷酸环化酶产生胞内cAMP时，cAMP与RIIβB结合，引起结合域构象变化，并通过连接肽传递至环状荧光素酶，改变其催化荧光素（luciferin）氧化发光的效率。加入GloSensor cAMP Reagent后，cAMP浓度越高，荧光素酶活性/发光输出越强，信号以相对发光单位（RLU）读出。22F通过降低cAMP亲和力（EC50由0.3 μM升至9 μM）并提高最大信背比，将高浓度端线性范围扩大至0.003–10 μM，从而在活细胞中实时、非破坏性地反映cAMP动力学。
检测灵敏度
线性范围: 0.003–10 μM（22F体外）；总动态范围: 0.003–100 μM；EC50: 0.3 to 9 μM（20F到22F）；最大S/B: 100-fold（20F）vs 3500-fold（22F）
效应效果
22F保持配体选择性不变，并在HEK293细胞中更好地区分ADRB2完全激动剂与部分激动剂，响应范围达800-fold，20F仅20-fold。与EIA相比，22F在激动剂、拮抗剂和forskolin处理下的信号幅度与动力学高度一致；EIA检测范围为0.078–20 nM，超过20 nM需稀释。与TRF相比，100 μM IBMX下22F的XC50为14.3 nM、Z'为0.82，TRF为17.8 nM、0.56；PGE2饱和剂量下22F的S/N为230，TRF为8，检测窗口大29倍。该活细胞非破坏格式适合高通量筛选、别构调节剂发现和偏倚激动研究。
传感器的构成
- 表达载体：pGloSensor-22F cAMP质粒（pF1K/pF9A衍生载体），编码22F融合蛋白并用于HEK293细胞瞬时转染
- 识别元件：PKA调节亚基RIIβB的cAMP结合域（RIIβB），结合胞内cAMP并发生构象变化
- 连接肽：N端linker peptide（GSSGGSGGSGGG衍生突变体），连接荧光素酶N端片段与RIIβB并调控动态范围
- 换能元件：环状排列的Photinus pyralis荧光素酶（CP firefly luciferase），受cAMP结合域构象调控并催化发光
- 底物/信号标记物：GloSensor cAMP Reagent（含luciferin荧光素底物），为荧光素酶提供发光底物
- 细胞基质：HEK293活细胞（或其他哺乳动物细胞），表达传感器并维持胞内cAMP生理环境
- 读出系统：Varioskan Flash或GloMax发光检测仪，测量相对发光单位（RLU）
中文摘要
环磷酸腺苷（cAMP）是G蛋白偶联受体（GPCR）激活后信号转导的关键第二信使。研究Gs偶联受体时，需要一种能够连续监测cAMP浓度动力学变化并覆盖较宽动态范围的检测手段。为此，作者通过进化改造了一种cAMP发光生物传感器，使其更好地覆盖活细胞中存在的生理浓度范围。与免疫分析相比，进化后的生物传感器构型能够以更低劳动强度的格式准确追踪cAMP变化的幅度和动力学。作者还展示了该构型检测宽范围受体活性的实用性，并证明其适用于高通量筛选。该设计有助于实时监测受体脱敏和cAMP周转等生理过程。
英文摘要
The second messenger cAMP is a key mediator of signal transduction following activation of G-protein coupled receptors. Investigations on Gs-coupled receptors would benefit from a second messenger assay that allows continuous monitoring of kinetic changes in cAMP concentration over a broad dynamic range. To accomplish this, we have evolved a luminescent biosensor for cAMP to better encompass the physiological concentration ranges present in living cells. When compared to an immunoassay, the evolved biosensor construct was able to accurately track both the magnitude and kinetics of cAMP change using a far less labor intensive format. We demonstrate the utility of this construct to detect a broad range of receptor activity, together with showing suitability for use in high-throughput screening.