组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
对氧磷（paraoxon，有机磷农药）；样品基质为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）/水相稀释液
检测原理
该传感器基于酶抑制原理。首先，(His)6-AChE 通过 His 标签与 Ni/NiO 纳米颗粒表面的 NiO 发生特异性亲和结合，实现定向固定并保持催化活性。检测时，AChE 催化底物 ATCh 水解，生成硫代胆碱（thiocholine）；硫代胆碱在 SPE 工作电极表面发生氧化，产生与酶活性成正比的安培电流。当对氧磷存在时，其与 AChE 活性位点结合并抑制酶催化，使硫代胆碱生成减少，氧化电流下降。电流下降程度随对氧磷浓度增加而增大，以 20% 抑制（I20）定义检出限。Ni/NiO 层提供导电、电催化和亲和固定界面，无额外信号放大策略。
检测灵敏度
LOD: 10^-12 M（paraoxon，I20，20 min incubation）；paraoxon 检测范围: 10^-8–10^-13 M；ATCh 线性范围: 0.1–1 mM；灵敏度: 37.2 nA/mM
效应效果
该传感器对 His 亲和固定具有特异性：咪唑可竞争性置换 (His)6-AChE，置换后无电流响应；未氧化镍表面不结合 His 标签酶。重现性为 7.4%（n=9），0.6 mM ATCh 平均电流 25±1.86 nA。操作稳定性可连续 8 次测定，之后活性快速下降，作者认为对一次性抑制检测足够。表观 Michaelis 常数 Kappm 为 0.9 mM，高于可溶酶 0.38 mM，但低于 Ni-IDA 磁性微球固定酶的 1.04 mM。对氧磷 10^-8 M 可完全抑制酶，LOD 为 10^-12 M，比 Ni-NTA 螯合固定 AChE 生物传感器灵敏度高约三个数量级。作者认为该方法可用于快速、低成本、高灵敏的有机磷农药毒性检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：石墨丝网印刷电极（SPE），工作层为石墨/羟乙基纤维素/TCNQ 复合材料，提供导电与电子转移
- 纳米材料修饰层：电沉积镍纳米颗粒（Ni NPs）并氧化形成 Ni/NiO 层，提供高表面积、导电性和 NiO 亲和固定位点
- 封闭剂：BSA（血清白蛋白），封闭非特异吸附位点
- 识别元件：(His)6 标记乙酰胆碱酯酶（(His)6-AChE），通过 His 标签与 NiO 定向亲和固定，催化 ATCh 水解
- 信号底物：乙酰硫代胆碱（ATCh），被 AChE 水解生成硫代胆碱（thiocholine），在电极表面氧化产生电流
- 检测读出：三电极电化学体系（Ag/AgCl 参比、Pt 对电极、SPE 工作电极）与恒电位仪安培测量
中文摘要
本文报道了一种将 (His)6 标记乙酰胆碱酯酶（AChE）通过位点特异性亲和固定到 Ni/NiO 纳米颗粒上，用于构建检测有机磷农药的电化学丝网印刷生物传感器的方法。该方法基于 His 标记酶与氧化镍纳米颗粒表面在无金属螯合剂存在下的特异性亲和结合，可在一步法中实现酶通过外部 His 残基稳定、定向地附着于氧化镍表面。该策略避免了扩散屏障，有利于快速、灵敏地检测对氧磷（paraoxon），检测浓度范围为 10^-8 至 10^-13 M。孵育 20 min 后，对氧磷的检出限为 10^-12 M。该方法可作为固定其他 His 标记酶、开发新型生物传感器的通用策略。
英文摘要
This paper reports site-specific affinity immobilization of (His)6-tagged acetylcholinesterase (AChE) onto Ni/NiO nanoparticles for the development of an electrochemical screen-printed biosensor for the detection of organophosphate pesticides. The method is based on the specific affinity binding of the His-tagged enzyme to oxidized nickel nanoparticle surfaces in the absence of metal chelators. This approach allows stable and oriented attachment of the enzyme onto the oxidized nickel through the external His residue in one-step procedure, allowing for fast and sensitive detection of paraoxon in the concentration range from 10(-8) to 10(-13) M. A detection limit of 10(-12) M for paraoxon was obtained after 20 min incubation. This method can be used as a generic approach for the immobilization of other His-tagged enzymes for the development of biosensors.