组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
凝血酶（thrombin）；样品基质：PBS 缓冲液（含 5 mM KCl、1 mM MgCl2，部分样品含 400 nM BSA），面向血液蛋白检测
检测原理
该传感器采用无标记 SPR 检测。胺端适配体通过 EDC/NHS 与 MPA 自组装单分子层上的羧基形成酰胺键，共价固定于金膜表面；乙醇胺封闭未反应位点，磷酸清洗非特异吸附。当凝血酶流过传感表面时，与适配体特异性结合，使金膜界面质量与局部折射率增加。在 Kretschmann 配置中，LED 发出的 p 偏振光经棱镜入射到金膜并激发表面等离子体，结合层折射率变化导致 SPR 反射强度最小值对应的角度发生偏移。光电二极管阵列实时记录 SPR 角变化，凝血酶浓度越高，SPR 角偏移越大，在 5–1000 nM 范围内呈线性响应。检测后使用磷酸再生表面，无需酶或核酸放大。
检测灵敏度
线性范围: 5 nM–1000 nM；optimal detectable range: 5–1000 nM
效应效果
传感器对凝血酶具有良好选择性：在 5–2000 nM 凝血酶样品中加入 400 nM BSA 后，适配体修饰表面的 SPR 响应与无 BSA 组几乎一致，而裸金表面受 BSA 影响明显；BSA 仅轻微降低灵敏度，不影响可逆性。重现性方面，每个适配体制备 3 片传感片，测量标准偏差小于总信号的 2%。可逆性测试中，同一浓度样品重复加载 10 次，每次响应约下降 0.5%，第 10 次仍保持原始 SPR 偏移的 95% 以上。作者认为该两步固定法成本低、密度均匀，性能可与抗体传感器相当，动态范围 5–1000 nM 覆盖人血凝血酶低纳摩尔至低微摩尔水平，适合血液蛋白临床检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：玻璃盖玻片/Ti/Au（1 nm Ti、50 nm Au），提供 SPR 金膜与光学反射界面
- SAM 修饰层：3-巯基丙酸（MPA）自组装单分子层，提供羧基用于共价偶联
- 活化层：NHS 与 EDC（N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride），活化 MPA 羧基
- 识别元件：胺端 DNA 适配体 APT1/APT2，特异性识别凝血酶
- 封闭/清洗层：乙醇胺（EA）封闭未反应 MPA 位点，磷酸（PPA）去除非特异吸附
- 信号标记物：无（label-free SPR，直接监测结合引起的折射率变化）
- 样品介质：0.1 M pH 7.2 PBS 运行缓冲液，样品含 5 mM KCl 和 1 mM MgCl2
- 读出装置：SensiQ Discovery SPR 系统（LED、棱镜、光电二极管阵列），记录 SPR 角/强度变化
中文摘要
本文报道了一种适用于血液蛋白高特异性检测的通用表面等离子共振（SPR）生物传感器方法。研究以凝血酶（thrombin）及其结合适配体（aptamer）为模型体系，采用两步自组装单分子层（SAM）固定策略，将胺端 DNA 适配体共价固定于金修饰 SPR 传感表面。首先，在玻璃基底上沉积钛和金膜，随后用 3-巯基丙酸（MPA）形成 SAM，并通过 EDC/NHS 活化羧基，使胺端适配体稳定偶联；乙醇胺封闭未反应位点，磷酸清洗非特异吸附。SPR 检测无需标记，直接监测凝血酶与适配体结合引起的界面折射率变化。传感器在 5–1000 nM 范围内具有良好线性响应，并表现出较好的可逆性、灵敏度和选择性，加入 400 nM 牛血清白蛋白（BSA）时响应几乎不变。该方法有望推广至其他血液蛋白的直接检测，用于临床诊断。
英文摘要
This paper presents a generally applicable approach for the highly specific detection of blood proteins. Thrombin and thrombin-binding aptamers are chosen for demonstration purposes. The sensor was prepared by immobilizing amine-terminated aptamers onto a gold modified surface using a two-step self-assembled monolayer (SAM) immobilization technique and the physical detection is performed using Surface Plasmon Resonance (SPR). The developed sensor has an optimal detectable range of 5-1000 nM and the results show the sensor has good reversibility, sensitivity and selectivity. Furthermore, the sensor shows the potential of being improved and standardized for direct detection of other blood proteins for clinical applications.