组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
ATP（adenosine 5'-triphosphate, ATP）；样品基质：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）阴门肌肉细胞及原代培养细胞（胞质与线粒体）
检测原理
ATeam 是基因编码 FRET 型 ATP 传感器，由 CFP、YFP 和枯草芽孢杆菌 F1F0-ATP 合酶 e 亚基串联组成。ATP 与 e 亚基结合后，e 亚基发生显著构象变化，使 CFP 与 YFP 之间的物理距离缩短，FRET 效率升高。实验中用 CFP 激发，同时采集 CFP 和 YFP 发射图像，并以 YFP/CFP 发射比作为 ATP 水平的读出信号；ATP 浓度升高时比值增大，ATP 浓度降低时比值下降。文中选用 AT1.03（ATP Kd 为 3.3 mM）在 25°C 下工作。将 ATeam 表达于线虫胞质或线粒体后，2-脱氧葡萄糖和氰化钾分别抑制糖酵解与氧化磷酸化，使胞质 ATP 下降，FRET 信号随之降低。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
转基因线虫寿命、体型和游泳周期与野生型 N2 相似，表明 ATeam 表达无明显表型异常。L4 阴门肌肉细胞中，胞质 YFP/CFP 比为 1.98±0.13，线粒体为 1.68±0.24（P<0.001），说明胞质 ATP 高于线粒体，与哺乳动物细胞一致。第 8 天老龄线虫比值与 L4 大致相同，未见衰老相关 ATP 变化；但肠道内源荧光干扰体壁肌肉测量，老龄时测量更困难。原代培养细胞经 2DG 和 KCN 处理 10 min 后，胞质 FRET 降至未处理约一半，DsRed 不受影响，证明 ATeam 可响应 ATP 变化。作者认为可用于线虫体内 ATP 动态监测。
传感器的构成
- 表达调控层：unc-54 启动子，驱动 ATeam 在线虫体壁和阴门肌肉细胞表达
- 定位元件：线粒体信号序列（mitochondrial signal sequence），融合于 ATeam 5'端，将 ATeam 靶向线粒体；无该序列则定位于胞质
- 识别元件：ATeam 蛋白（AT1.03），由 CFP、YFP 和枯草芽孢杆菌 F1F0-ATP 合酶 e 亚基组成，结合 ATP 并发生构象变化
- 荧光标记层：CFP（cyan fluorescent protein）和 YFP（yellow fluorescent protein），作为 FRET 供体/受体，距离变化改变 FRET 效率
- 对照标记：DsRed（红色荧光蛋白变体），共注射用于标记咽部肌肉细胞并作为转化标记
- 成像基底：盖玻片（cover glass）和玻璃底培养皿（glass-bottomed dish），用于固定线虫或培养细胞并荧光成像
- 信号读出：冷却 CCD 相机（ORCA-AG, Hamamatsu Photonics）与 MetaMorph 软件，采集 CFP/YFP 图像并计算 YFP/CFP 比值
中文摘要
三磷酸腺苷（ATP）是主要能量货币，参与许多生物过程。动物细胞中的 ATP 监测系统有助于研究能量代谢与生物过程的关系。基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光 ATP 生物传感器 ATeam（基于 ε 亚基的分析测量 ATP 指示剂）已被报道用于监测培养细胞中的 ATP 水平，作者通过显微注射和紫外线照射方法将其引入线虫。为确认 ATeam 是否在线虫细胞中作为 ATP 传感器，作者测量了转基因线虫细胞中 ATeam 的 FRET。结果显示 ATeam 在线虫靶细胞中表达。在阴门细胞中，胞质 ATP 水平高于线粒体。ATeam 还能感知转基因线虫培养细胞中 ATP 水平的变化。这些实验表明 ATeam 可用于检测线虫细胞中 ATP 水平的变化。
英文摘要
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) is the major energy currency and is involved in many biological processes. The ATP-monitoring system for cells in animals can be helpful to study the relationship between energy metabolism and biological processes. The fluorescent ATP biosensor ATeam (ATP indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements), which has been reported to monitor ATP levels in cultured cells on the basis of fluorescence resonance energy transfer (FRET), was introduced into nematodes by microinjection and UV-irradiation method. To confirm whether ATeam functions as an ATP sensor in nematode cells, the authors measured FRET of ATeam in cells of transgenic nematode. The ATeam was expressed in target cells in nematode. In vulva cells, ATP levels in the cytosol were higher than those in mitochondria. ATeam also sensed ATP level change in cultured cells from the transgenic nematode. These experiments indicated that ATeam is available for detection of changes in ATP levels in nematode cells.