组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
葡萄糖（glucose）；样品基质：N2 饱和缓冲液（pH 7）
检测原理
葡萄糖进入工程化 GOx 活性位点并被催化氧化为葡萄糖内酯，同时 FAD 被还原为 FADH2。在 N2 饱和缓冲液中排除氧气竞争后，FADH2 的电子经位点特异性连接的马来酰亚胺修饰 AuNP 向金电极直接转移，电极发生 FADH2 氧化并产生氧化电流。AuNP 作为电子中继缩短 FAD 与电极的隧穿距离，克服蛋白球状结构绝缘，实现无需小分子介质的直接电子转移。葡萄糖浓度升高时，酶催化氧化速率增加，氧化电流增大，开路电位负移并趋于约 -370 mV，接近 FAD/FADH2 形式电位。
检测灵敏度
未报告
效应效果
五种突变体中仅 H447C-AuNP 在金电极上呈现显著 DET 氧化电流，起始约 -400 mV，未连接 AuNP 的 H447C 无 DET，说明 FAD-电极距离决定电子转移。AuNP 连接使表观 kcat 降低但 KM 降低：H447C 由 15.0±4.4 mM 降至 8.2±2.5 mM，商业 GOx 由 96.4±28.3 mM 降至 6.3±0.9 mM；电化学 KM 由 155±14 mM 降至 75±10 mM。共轭物残余活性 25–40% 且 16 h 稳定。葡萄糖增加使开路电位负移，约 1 M 时达 -370 mV。原文未报告选择性、RSD 或回收率；作者认为可用于第三代安培生物传感器或酶生物燃料电池阳极。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（gold electrode），固定 GOx-AuNP 共轭物并作为电子换能器读取电流/电位
- 纳米材料修饰层：马来酰亚胺修饰金纳米颗粒（maleimide-modified AuNP，1.4 nm），通过硫醚键与酶表面半胱氨酸共价连接，作为电子中继
- 识别元件：工程化葡萄糖氧化酶（GOx，Aspergillus niger H447C 突变体），催化葡萄糖氧化并携带 FAD 氧化还原辅因子
- 氧化还原辅因子：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD/FADH2），位于 GOx 核心，接受葡萄糖电子并向 AuNP 传递
- 被测物：葡萄糖（glucose），与 GOx 活性位点结合并被氧化为葡萄糖内酯
- 反应介质：N2 饱和缓冲液（pH 7），排除氧气竞争并提供反应环境
- 信号读出：电化学检测（CV、安培、OCP、极化曲线），检测氧化电流或电位变化
中文摘要
优化酶与电极之间的电子通信是发展生物传感器、酶生物燃料电池及其他生物电催化应用的关键。本文报道了一种对葡萄糖氧化酶（GOx）进行简单遗传改造的策略，使其在活性位点附近显示一个游离巯基。该游离半胱氨酸可与马来酰亚胺修饰的金纳米颗粒（AuNP）发生特异性硫醚化反应，从而在酶表面位点特异性地连接 AuNP。这种“预接线”的酶-AuNP 共轭物能够在共轭酶与电极之间建立直接电通信，避免使用小分子氧化还原介质带来的成本、毒性和扩散损失。作者以黑曲霉 GOx 双突变体为基础，通过定点突变引入不同距离的表面半胱氨酸，并筛选出与 FAD 辅因子距离最近的 H447C 突变体。该突变体连接 AuNP 后在金电极上表现出葡萄糖氧化的直接电子转移电流，表明 AuNP 可作为电子中继桥接 FAD 与电极。该策略对开发第三代安培生物传感器和酶生物燃料电池阳极具有重要价值。
英文摘要
Optimizing the electrical communication between enzymes and electrodes is critical in the development of biosensors, enzymatic biofuel cells, and other bioelectrocatalytic applications. One approach to address this limitation is the attachment of redox mediators or relays to the enzymes. Here we report a simple genetic modification of a glucose oxidase enzyme to display a free thiol group near its active site. This facilitates the site-specific attachment of a maleimide-modified gold nanoparticle to the enzyme, which enables direct electrical communication between the conjugated enzyme and an electrode. Glucose oxidase is of particular interest in biofuel cell and biosensor applications, and the approach of "prewiring" enzyme conjugates in a site-specific manner will be valuable in the continued development of these systems.