组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
胸腺嘧啶相关单核苷酸多态性（thymine-related SNP，T/C突变）；样品基质：含AP位点DNA探针杂交后的DNA双链及63-mer Ha-ras基因codon 12反义链PCR扩增产物（纯化后缓冲液）
检测原理
含AP位点的DNA探针与目标单链DNA杂交，使AP位点正对目标碱基，形成可被小分子识别的结合口袋。固定于CM5芯片的DAP-S7通过氢键互补选择性结合孤儿胸腺嘧啶，DMP-S3则选择性结合胞嘧啶。配体结合使传感器表面质量增加，引起SPR共振角偏移，Biacore 3000以共振单位（RU）读出信号；目标碱基浓度越高，结合量越大，RU响应越强。通过调节NaCl浓度可改变静电屏蔽和结合选择性，0.25 M NaCl下兼顾灵敏度与选择性。双通道FC2/FC3同时记录C和T选择性响应，利用散点图区分C/C、C/T和T/T基因型。该过程无需酶催化或核酸扩增，灵敏度部分受益于SPR对表面质量变化的敏感性及连续流动中的质量传输效应。
检测灵敏度
线性范围: 10–100 nM；10 nM 时 T 响应 11±0.6 RU，G 4.8±0.2 RU，A 3.8±0.4 RU，C 3.3±0.1 RU，完全匹配双链 1.6±0.3 RU（0.25 M NaCl, pH 6.4）
效应效果
在0.25 M NaCl、pH 6.4条件下，DAP-S7传感器对10 nM胸腺嘧啶双链产生11±0.6 RU响应，而鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和完全匹配双链分别为4.8±0.2、3.8±0.4、3.3±0.1和1.6±0.3 RU，显示明显T选择性；提高盐浓度至0.50 M可进一步增强选择性但降低响应。传感器在pH 5.6–8.0内保持响应与选择性，20次连续测量无衰减。DMP-S3与DAP-S7双通道组合可将C/C、C/T、T/T三种基因型在散点图中清晰分开，并成功分析12个Ha-ras基因codon 12 PCR样本（3个T/T、3个C/C、3个杂合、3个对照）。与均相荧光检测相比，表面固定提高了灵敏度；与杂交吸附SPR相比，减少了探针设计和杂交温度控制。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore CM5 SPR芯片（金膜/羧甲基葡聚糖表面），提供SPR换能与羧基固定位点
- 活化层：EDC/NHS活化羧甲基葡聚糖，形成氨基反应性表面用于配体偶联
- 识别配体层：DAP-S7（3,5-二氨基吡嗪衍生物）固定于FC3，选择性结合AP位点相对的胸腺嘧啶
- 识别配体层：DMP-S3（二甲基蝶啶衍生物）固定于FC2，选择性结合AP位点相对的胞嘧啶
- 封闭剂：乙醇胺盐酸盐（ethanolamine hydrochloride），封闭未反应羧基
- 识别探针（样品中）：含AP位点的20/21-mer DNA探针（C3 spacer），与目标ssDNA杂交形成结合口袋
- 再生剂：6 M盐酸胍（guanidine hydrochloride），洗脱结合物并再生表面
中文摘要
报道了一种携带DNA结合小分子配体的表面等离子共振（SPR）生物传感器，用于检测单核苷酸多态性（SNP）。以氢键模式与胸腺嘧啶完全互补的3,5-二氨基吡嗪衍生物作为传感器表面识别元件，将含无碱基位点（AP位点）的DNA探针与目标单链DNA杂交，使AP位点正对待检测碱基。在pH 6.4、0.25 M NaCl的连续流动样品中，该传感器可检测双链中的孤儿碱基，并对胸腺嘧啶相对于胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤表现出明显选择性（5'-GTT GGA GCT GXG GGC GTA GGC-3'/3'-CAA CCT CGA CNC CCG CAT CCG-5'；X=AP位点，N=G、C、A或T）。SPR响应在10–100 nM范围内线性。通过在同一SPR流道中组合不同结合表面，可实现等位基因区分，并用于分析63碱基PCR扩增产物（Ha-ras基因第12密码子反义链）中的胸腺嘧啶/胞嘧啶突变。与基于3,5-二氨基吡嗪/DNA结合的均相检测相比，表面固定可提高目标DNA检测灵敏度，且可通过调节样品盐浓度调控结合选择性。
英文摘要
A surface plasmon resonance (SPR) biosensor that carries DNA-binding small ligands has been developed for the detection of single-nucleotide polymorphisms (SNPs). 3,5-Diaminopyrazine derivatives, with a hydrogen-bonding profile fully complementary to the thymine base, were utilized as recognition elements on the sensor surface, and a target single-stranded DNA sequence was hybridized with a DNA probe containing an abasic site to place this site opposite a nucleobase to be detected. In a continuous flow of sample solutions buffered to pH 6.4 (0.25 M NaCl), the 3,5-diaminopyrazine-based SPR sensor can detect an orphan nucleobase in the duplex with a clear selectivity for thymine over cytosine, guanine, and adenine (5'-GTT GGA GCT GXG GGC GTA GGC-3'/3'-CAA CCT CGA CNC CCG CAT CCG-5'; X=abasic site, N=target nucleobase G, C, A, or T). The SPR response was linear in the concentration range 10-100 nM. Allele discrimination is possible based on the combination of different binding surfaces in a flow cell of the SPR system, which is demonstrated for the analysis of the thymine/cytosine mutation present in 63-meric polymerase chain reaction (PCR) amplification products (Ha-ras gene, codon 12, antisense strand). Comparison with a bulk assay based on 3,5-diaminopyrazine/DNA binding shows that the immobilization of 3,5-diaminopyrazine derivatives on the SPR sensor allows more sensitive detection of the target DNA sequence, and binding selectivity can be tuned by controlling the salt concentration of sample solutions. These features of the DNA-binding small-molecule-immobilized SPR sensor are discussed as a basis for the design of SPR biosensors for SNP genotyping.