Bacterial whole-cell biosensor for glutamine with applications for quantifying and visualizing glutamine in plants.

全细胞生物传感器

谷氨酰胺（glutamine, Gln）；样品基质：植物组织提取液（玉米叶片提取液，1000 倍稀释）、冻融植物器官（根、叶）释放物/琼脂成像

GlnLux 以大肠杆菌 glnA 敲除营养缺陷型为识别与换能核心。菌株不能合成谷氨酰胺，必须从外界摄取 Gln 才能生长。检测前用无 Gln 的 M9 培养基洗涤、稀释并延长孵育，以耗竭细胞内源 Gln，降低背景。样品中的 Gln 进入细胞后被转运和代谢，支持细胞生长与存活；质粒 pT7-lux 中的 luxCDABE 由组成型 T7 启动子持续表达，产生生物发光。因此 Gln 浓度越高，可生长/代谢的细胞越多，发光信号越强。定量检测在 96 孔板中用发光仪读取相对发光单位（RLU）；成像检测将冻融植物器官置于含 GlnLux 的琼脂上，Gln 从组织扩散进入琼脂并被菌响应，CCD 相机捕获光子分布。该策略利用营养缺陷型生长耦合组成型生物发光，实现低背景、可空间分辨的 Gln 检测。

灵敏度(LOD): 0.0001 μg/ml (0.68 nM)；线性范围: 0.0001–0.1 μg/ml；成像灵敏度阈值: 0.01–0.1 mM；Spearman's r = 0.95 (P < 0.0001)

GlnLux 与 HPLC 测定玉米叶片提取液游离 Gln 的结果高度一致，Spearman r=0.95，P<0.0001，自由度 39；每孔仅需约 1 μg 组织，即可区分铵/硝酸盐施肥与未施肥植株。选择性方面，在植物提取液 1000 倍稀释后，NH4Cl（约 90 μM）、KNO3（约 200 μM）、NaNO2（约 0.3 μM）及 19 种氨基酸混合物（3–110 μM）未引起显著交叉反应，但更高硝酸盐或氨基酸浓度可能激活信号。成像实验中，GlnLux agar 可显示氮处理根系信号高于水处理根系，施肥叶片信号显著高于缺氮叶片，并在施肥玉米叶 2 中呈现基部至中部主脉区域最高、尖端最低的空间分布，与已知 Gln 积累模式一致。作者认为该传感器可半定量可视化植物氮吸收、同化与长距离运输，并可用于高通量筛选氮代谢突变体，与植物 FRET 型 Gln 传感器互补。

本研究构建了一种用于检测谷氨酰胺（glutamine, Gln）的大肠杆菌全细胞生物传感器 GlnLux。该传感器以谷氨酰胺营养缺陷型大肠杆菌 JW3841-1（glnA732::Kan）为细胞换能器，通过转入由组成型 T7 启动子驱动的费氏弧菌 luxCDABE 发光操纵子质粒 pT7-lux 实现信号输出。由于菌株缺失谷氨酰胺合成酶，其生长依赖外源 Gln；在无 Gln 的 M9 培养基中洗涤和稀释可耗竭内源 Gln 并降低背景。加入含 Gln 样品后，细胞利用 Gln 恢复生长，组成型表达的 luxCDABE 产生生物发光，发光强度随 Gln 浓度增加而增强。优化后，GlnLux 对 Gln 标准品的灵敏度为 0.0001 μg/ml（0.68 nM），线性范围跨 3 个数量级（0.0001–0.1 μg/ml）。与 HPLC 测定玉米叶片提取液游离 Gln 的结果高度相关（Spearman r=0.95，P<0.0001），并能区分铵/硝酸盐施肥与未施肥植株。将冻融植物器官置于含 GlnLux 的琼脂上，还可用 CCD 相机原位成像根、叶中 Gln 分布，为植物氮吸收、同化和长距离运输研究提供快速、低成本、可空间可视化的检测手段。