组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH，GSH/GSSG 偶联）；样品基质：果蝇（Drosophila melanogaster）活体组织与解剖固定组织，细胞质和线粒体区室。
检测原理
探针由 roGFP2 与 Grx1 或 Orp1 融合构成。roGFP2 表面含工程化二硫键/双硫键开关，氧化态改变使 405 nm 与 488 nm 激发荧光强度比变化。Grx1 介导 GSSG 对 roGFP2 的氧化，使探针与细胞 GSH/GSSG 池平衡，从而报告 EGSH；Orp1 被 H2O2 氧化后氧化邻近 roGFP2，从而报告 H2O2。线粒体定位序列或胞质定位决定区室特异性。解剖固定时 NEM 烷基化探针巯基，锁定体内氧化还原态，避免 PFA 造成人工氧化。共聚焦显微镜顺序激发 405/488 nm，计算荧光比，并用 DTT/DA 校准完全还原/氧化态。该体系不依赖外源信号放大，而依靠酶偶联提高化学特异性与比率荧光读出。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
四种探针在 DTT/DA 原位校准下动态范围为 5–7，roGFP2 比值在 pH 5.5–8.5 内稳定。NEM（至少 2 mM）可在解剖和 PFA 固定中锁定探针氧化还原态，并抵抗后续 DA 氧化，使深层组织成像可行。活体幼虫成像显示组织间氧化还原差异可重复；衰老成蝇中肠胞质 H2O2 显著升高，chico1/+ 雌性寿命延长 8 天但肠道 H2O2 积累加快。TrxR、ND42、Jafrac1 基因沉默和抗霉素 A、NAC 处理均产生区室/组织特异性响应，NAC 未显示明显抗氧化作用，反而升高线粒体 H2O2。相比组织提取平均化方法，该体系可分辨组织与区室特异性，适用于体内氧化还原稳态、衰老和药物/基因干预研究。
传感器的构成
- 基底/表达宿主：果蝇细胞/组织（Drosophila tissue），作为探针表达与氧化还原微环境载体。
- 遗传表达元件：Tubulin-Gal4/UAS 或 tubulin 启动子，驱动探针在全身组织表达。
- 识别/偶联酶元件：Grx1（glutaredoxin 1）或 Orp1（oxidant receptor peroxidase 1），分别识别 GSSG 或 H2O2 并介导 roGFP2 氧化。
- 信号标记物：roGFP2（redox-sensitive GFP2），氧化还原状态改变引起 405/488 nm 荧光比变化。
- 亚细胞定位信号：mito- 定位序列或胞质定位，将探针靶向线粒体基质或细胞质。
- 化学锁定剂：NEM（N-ethyl maleimide），烷基化探针巯基以锁定体内氧化还原态。
中文摘要
谷胱甘肽氧化还原偶联（GSH/GSSG）和过氧化氢（H2O2）是氧化还原稳态与氧化还原信号的核心，但它们在生物体内的分布难以测量。本研究在果蝇中利用遗传编码氧化还原探针，建立了在发育和衰老过程中对细胞质和线粒体等定义亚细胞区室中谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）和 H2O2 进行定量体内映射的方法。通过一种化学策略，在标本解剖和固定过程中捕获转基因生物传感器的体内氧化还原状态，将荧光氧化还原成像的范围扩展到成蝇的深层组织。研究发现，发育和衰老伴随的氧化还原变化具有明显的氧化还原偶联、亚细胞区室和组织特异性。中肠肠上皮细胞被确定为年龄依赖性胞质 H2O2 积累的显著部位。更长的寿命与肠道中氧化剂生成增加相关，而非减少。
英文摘要
The glutathione redox couple (GSH/GSSG) and hydrogen peroxide (H(2)O(2)) are central to redox homeostasis and redox signaling, yet their distribution within an organism is difficult to measure. Using genetically encoded redox probes in Drosophila, we establish quantitative in vivo mapping of the glutathione redox potential (E(GSH)) and H(2)O(2) in defined subcellular compartments (cytosol and mitochondria) across the whole animal during development and aging. A chemical strategy to trap the in vivo redox state of the transgenic biosensor during specimen dissection and fixation expands the scope of fluorescence redox imaging to include the deep tissues of the adult fly. We find that development and aging are associated with redox changes that are distinctly redox couple-, subcellular compartment-, and tissue-specific. Midgut enterocytes are identified as prominent sites of age-dependent cytosolic H(2)O(2) accumulation. A longer life span correlated with increased formation of oxidants in the gut, rather than a decrease.