组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
肿瘤坏死因子-α（TNF-α，tumor necrosis factor-alpha），样品基质：PBS 缓冲液（文中亦面向血清等生物流体）
检测原理
传感器以光子晶体（PC）表面为换能平台。PC 上通过 GPTMS 固定 TNF-α 捕获抗体，样品中的 TNF-α 与捕获抗体结合后，再依次结合生物素化二抗和链霉亲和素-Cy5，形成夹心 ELISA 荧光复合物。Cy5 位于 PC 倏逝场中，其荧光受 PC 共振模式调控。690 nm 激光用于无标记成像：捕获抗体点改变局部有效折射率，使最低透射角（AMT）发生空间偏移，据此生成点内/点间掩膜。632.8 nm 激光在 9.5°–10.5° 扫描，对点内区域选择共振耦合，增强激发与光子提取；点间区域离共振，抑制背景。TNF-α 浓度越高，Cy5 荧光越强，EMCCD 相机记录增强荧光强度。
检测灵敏度
LOD: 0.97 pg/ml；固定角度最低可测浓度: >3.9 pg/ml
效应效果
实验在 PBS 中用 TNF-α 标准品做剂量响应，浓度包括 1000、250、62.5、15.6、3.9 和 0.97 pg/mL。固定 10° 角度荧光检测时，3.9 与 0.97 pg/mL 信号不可区分，最低可测浓度大于 3.9 pg/mL；采用无标记 AMT 掩膜和角度扫描选择性增强后，0.97 pg/mL 与 3.9 pg/mL 可明显区分，检测限降至 0.97 pg/mL。方法提高了点间信号均匀性和图像对比度，并降低点间背景、基底自荧光及非特异结合影响。论文未报告 RSD、稳定性、实际血清回收率或与 ELISA/HPLC/qPCR 的定量对比，但作者认为该策略可推广至 DNA/蛋白微阵列和临床生物标志物检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：石英基底（quartz substrate，n=1.46），承载光子晶体并作为光学透射基底
- 光子晶体光栅层：亚波长光栅（grating，Λ=400 nm，d=50 nm，占空比30%，图注标为50%），形成光学共振结构
- 高折射率限制层：TiO2 介电层（n=2.35，t=140 nm），支持共振模式并增强荧光
- 表面化学修饰层：3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）气相沉积，提供反应位点用于抗体固定
- 识别元件：TNF-α 捕获抗体（capture antibody，0.8 mg/mL），点样形成微阵列并特异性结合 TNF-α
- 封闭剂：1% 酪蛋白（casein）PBS 溶液，封闭非特异结合位点
- 信号标记物：生物素化二抗（biotinylated secondary antibody，200 ng/mL）与链霉亲和素-Cyanine 5（streptavidin-Cy5，1 µg/mL），构成夹心 ELISA 荧光标记
- 读出系统：PCEM 双模成像系统（690 nm AlGaAs 激光、632.8 nm HeNe 激光、Olympus BX-51、EMCCD 相机），输出 AMT 无标记图与增强荧光图
中文摘要
本文提出将光子晶体（PC）无标记生物传感器成像与光子晶体增强荧光（PCEF）相结合的空间选择性荧光检测方法。利用 PC 表面固定捕获分子引起的共振角偏移，可先获得捕获点密度的无标记图像，并据此逐像素确定荧光成像激光的最佳耦合条件。该方法使含生物分子捕获点的区域处于共振耦合状态，从而最大化荧光增强因子；同时使点间区域处于离共振状态，抑制基底、封闭剂和背景自荧光。作者构建了双模光子晶体增强显微镜（PCEM），采用 690 nm 激光进行无标记最低透射角（AMT）成像，采用 632.8 nm 激光进行角度扫描荧光成像，并通过图像处理生成选择性增强荧光图像。将该方法应用于 TNF-α 抗体微阵列夹心 ELISA 检测，可显著提高图像对比度和点间均匀性，在缓冲液中将代表性蛋白生物标志物的检测限降至 0.97 pg/mL。
英文摘要
By combining photonic crystal label-free biosensor imaging with photonic crystal enhanced fluorescence, it is possible to selectively enhance the fluorescence emission from regions of the PC surface based upon the density of immobilized capture molecules. A label-free image of the capture molecules enables determination of optimal coupling conditions of the laser used for fluorescence imaging of the photonic crystal surface on a pixel-by-pixel basis, allowing maximization of fluorescence enhancement factor from regions incorporating a biomolecule capture spot and minimization of background autofluorescence from areas between capture spots. This capability significantly improves the contrast of enhanced fluorescent images, and when applied to an antibody protein microarray, provides a substantial advantage over conventional fluorescence microscopy. Using the new approach, we demonstrate detection limits as low as 0.97 pg/ml for a representative protein biomarker in buffer.