组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
游离胆固醇（free cholesterol, cholesterol）、总胆固醇（以胆固醇油酸酯 cholesteryl oleate 为模型）；样品基质：磷酸盐缓冲生理盐水（PBS, pH 7.4）
检测原理
传感器以4-ATP/Au为界面，ChOx直接识别游离胆固醇，ChEt先将胆固醇酯水解为游离胆固醇，再由ChOx催化氧化。ChOx的FAD中心参与胆固醇氧化，生成cholest-4-en-3-one和H2O2；H2O2在循环伏安扫描中分解产生H+，H+被4-ATP吸收并形成醌二亚胺结构，使约0.33 V处氧化峰电流随底物浓度升高而增大。4-ATP的共轭芳香结构作为分子导线，促进酶活性中心与金电极间电子转移，因此无需人工氧化还原介质。低电位检测可避免尿酸、抗坏血酸等干扰物氧化，实现游离胆固醇和总胆固醇的无干扰电化学测定。
检测灵敏度
线性范围: 25–400 mg dl-1；灵敏度: 542.3 nA mM-1（ChOx/4-ATP/Au）、886.6 nA mM-1（ChEt-ChOx/4-ATP/Au）；响应时间: 20 s
效应效果
该传感器在0.33 V低电位下实现无干扰检测，尿酸（0.1 mM）、抗坏血酸（0.05 mM）、乳酸（0.5 mM）和尿素（1 mM）均不引起显著响应变化。热稳定性良好，峰电流随温度升高至约50 °C后下降，表明在高于体温37 °C仍稳定；储存寿命约4个月，保留90%以上初始活性，可重复使用20次。表观米氏常数Kapp_m为1.34 mM（ChOx/4-ATP/Au）和1.06 mM（ChEt-ChOx/4-ATP/Au），Vmax为6.20 mA和7.06 mA，显示酶对胆固醇亲和力较好。与文献中其他单分子层胆固醇传感器相比，该体系无需人工介质，响应时间20 s，灵敏度更高，作者认为其适合用于胆固醇快速检测，但尚未在真实样品中验证。
传感器的构成
- 基底电极：金板（Au），经piranha溶液清洗，作为导电基底与电子转移动态界面。
- 自组装修饰层：4-氨基硫酚（4-aminothiophenol, 4-ATP）SAM，2 mM乙醇溶液室温自组装18 h，形成致密共轭芳香单分子层并提供氨基。
- 交联固定层：EDC与NHS，零长度交联体系，将酶表面羧基与4-ATP氨基共价偶联形成酰胺键。
- 识别元件：胆固醇氧化酶（ChOx）用于游离胆固醇；胆固醇酯酶（ChEt）与ChOx按1:1混合用于总胆固醇，催化底物生成H2O2。
- 信号转导层：无外加人工氧化还原介质；4-ATP共轭结构作为分子导线促进电子转移，并在0.33 V产生氧化响应。
中文摘要
本文报道了一种基于4-氨基硫酚（4-ATP）自组装单分子层（SAM）的无介质酶生物传感器，用于检测游离胆固醇和总胆固醇。将胆固醇氧化酶（ChOx）以及胆固醇酯酶（ChEt）与ChOx的混合酶通过EDC-NHS化学共价固定于4-ATP/Au表面，制备ChOx/4-ATP/Au和ChEt-ChOx/4-ATP/Au生物电极。扫描电镜和电化学表征表明，4-ATP形成致密有序单分子层，酶固定后表面覆盖度较高。在pH 7.4磷酸盐缓冲生理盐水中，该传感器无需人工氧化还原介质即可实现快速酶促反应，归因于短链共轭芳香硫醇4-ATP的分子导线效应，可促进酶与金电极间电子转移。在0.33 V低工作电位下，可无干扰地测定游离胆固醇和总胆固醇，检测范围为25–400 mg dl-1，灵敏度分别为542.3 nA mM-1和886.6 nA mM-1，响应时间为20 s。
英文摘要
Self-assembled monolayer (SAM) of 4-aminothiophenol (4-ATP) has been investigated for immobilization of bi-enzymes (ChOx and ChEt) towards development of enzyme biosensors for detection of free and total cholesterol. This enzyme immobilized SAM surface has been characterized by scanning electron microscopy and electrochemical measurements. The results of electrochemical response studies reveal fast enzymatic reaction in phosphate buffer saline solution without using any artificial mediator. This may be attributed to the molecular wire type behavior of short 4-ATP molecule that promotes electron transfer between enzyme and the electrode surface due to its conjugated structure. Interference free estimation of free and total cholesterol has been realized at low operating potential of 0.33 V with range of detection as 25 to 400 mg dl(-1), sensitivity of 542.3 nA mM(-1) (for ChOx/4-ATP/Au) and 886.6 nA mM(-1) (for ChEt-ChOx/4-ATP/Au) with a response time of 20 s at pH 7.4.