组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）flhA基因21-mer DNA序列；样品基质：活菌基因组DNA的PCR扩增子（Tris缓冲液）
检测原理
金电极上先形成MCH疏水自组装层，再固定5′端带二茂铁（Fc）的3′-硫醇化发夹DNA探针。无靶标时，发夹茎保持，Fc靠近金表面；溶液中的Fe(CN)6^4-作为牺牲氧化还原剂与表面Fc发生氧化还原循环，产生放大的DPV电流。加入互补ssDNA靶标后，发夹打开并与靶标杂交形成双链，Fc与电极距离由约0.3 nm增至大于12.3 nm，电子转移受阻，电活性表面密度下降，DPV峰电流降低；同时异质电子转移速率常数变化引起峰电位偏移。DPV可抑制电容电流，信号随靶标浓度增加而下降，峰电位随浓度偏移，可用Langmuir等温线描述。
检测灵敏度
LOD: 2.3 × 10−14 M (current signal)；线性范围: 10−14–10−6 M (R^2 = 0.99)；LOD: 5.9 × 10−13 M (peak potential)；线性范围: 10−13–10−6 M (R^2 = 0.98)
效应效果
该传感器在55 ℃杂交条件下可区分互补靶标与单碱基错配（Lens株嗜肺军团菌）及三碱基错配（Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966）序列；非互补多胞嘧啶DNA在10^-6至10^-16 M范围内无显著响应。传感器可经75 ℃、30 min、pH 7.0 0.5 M Tris再生6次，单传感器平均标准误差2.6%，三个传感器误差为2%–9%。分析时间约45 min。检测限较比色、光学和荧光发夹DNA传感器提高5–6个数量级，与酶放大电化学DNA传感器和阻抗DNA传感器相当。作者认为其可用于病原微生物DNA的快速识别与定量。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），提供电子转导与电化学测量界面。
- 疏水封闭层：6-巯基-1-己醇（MCH）自组装单分子层，抑制非特异吸附并限制Fe(CN)6^4-直接电反应。
- 识别元件：3′-硫醇化发夹DNA探针（hairpin DNA probe），含6 bp短茎和16碱基环，识别嗜肺军团菌flhA基因21-mer靶标。
- 信号标记物：二茂铁（ferrocene, Fc）经6碳有机连接臂连接于探针5′端，作为可逆氧化还原标签。
- 信号放大剂：六氰合铁(II)酸根（Fe(CN)6^4-），作为牺牲性氧化还原再生剂，循环再生表面Fc并放大法拉第电流。
- 检测介质：1.0 M Tris缓冲液（pH 7.0）含1 mM Fe(CN)6^4-，用于杂交与DPV测量。
中文摘要
本文构建了一种电化学放大分子信标（EAMB）生物传感器，用于军团菌属DNA序列的特异性检测。该传感器以金电极为基底，固定3′-硫醇化发夹DNA-二茂铁探针。互补DNA靶标存在时，单个探针由开态切换为关态，由于电活性发夹DNA-二茂铁探针表面密度变化，影响电极电位和电流。文中采用Fe(CN)6^4-作为牺牲氧化还原再生剂放大电化学信号，并以DPV电流和峰电位双参数读出。该传感器对21-mer DNA序列具有8个数量级线性范围，超灵敏检测限为2.3×10^-14 M。其适用性以活体嗜肺军团菌基因组DNA的PCR扩增子进行测试，并显示对另一嗜肺军团菌菌株的单碱基错配和不同细菌物种的三碱基错配具有优异特异性。
英文摘要
An electrochemically amplified molecular beacon (EAMB) biosensor is constructed using thiolated hairpin DNA-ferrocene probes on gold electrode. The switching from "on" to "off" states of individual probes in the presence of complementary DNA target influences the electrode potential, besides the current, owing to changes in surface density of the electroactive hairpin DNA-ferrocene probes. The EAMB biosensor demonstrates linear range over 8 orders of magnitude with ultrasensitive detection limit of 2.3 × 10(-14)M for the quantification of a 21-mer DNA sequence. Its applicability is tested against PCR amplicons derived from genomic DNA of live Legionella pneumophila. Excellent specificity down to one and three nucleotides mismatches in another strain of L. pneumophila and a different bacterium species, respectively, is demonstrated.