组成图示
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传感器类型
比色生物传感器
检测对象
木糖醇（xylitol）；样品基质为磷酸钾缓冲液溶液及表达AldO-MP的大肠杆菌全细胞/周质提取物。
检测原理
AldO的FAD活性中心特异性结合并氧化木糖醇，以O2为电子受体，生成氧化产物和H2O2。由于MP292微过氧化物酶与AldO共价融合在同一蛋白骨架，H2O2可在分子内或近邻传递至血红素活性中心。血红素在H2O2作用下形成活性氧化态，催化DCHBS与AAP（或DMB）偶联显色，生成在515 nm（或460 nm）有特征吸收的有色产物。木糖醇浓度越高，氧化酶产生H2O2越多，过氧化物酶催化显色底物越多，吸光度越大，从而比色定量。该设计无需外加HRP或独立过氧化物酶，属于单组分酶级联检测。
检测灵敏度
可靠检测浓度: 2.3 mgL−1 (15 mM)；酶用量: 20 nM AldO-MP
效应效果
该融合酶在大肠杆菌周质中表达纯化，AldO-MP完全黄素化与血红素化，FAD/血红素与蛋白呈1:1；AldO-HB1仅15%含血红素。动力学显示氧化酶活性基本保留，xylitol Km 0.29/0.35 mM，kcat 9.1/12.2 s−1，接近野生型13.0 s−1；过氧化物酶以DMB为底物时H2O2 Km 12±5 mM，kcat 9.1±2.2 s−1，pH 8.5最优，pH 7.5保留约60%活性。比色法仅用20 nM AldO-MP即可可靠检测2.3 mgL−1（15 mM）木糖醇，并可在表达菌全细胞中检测氧化酶活性。实验重复三次，标准偏差约5%；过氧化物酶活性随时间缓慢衰减。作者认为该单组分杂交酶可用于级联反应和新型生物传感器。
传感器的构成
- 识别/催化层：AldO（共价FAD黄素蛋白氧化酶），特异性氧化木糖醇并产生H2O2。
- 信号转换层：MP292微过氧化物酶（CXXCH血红素结合肽，共价血红素），催化H2O2与显色底物反应。
- 融合蛋白骨架：Tat-Strep-AldO-MP，Tat信号序列介导大肠杆菌周质分泌，Strep-tag用于Strep-Tactin亲和纯化。
- 显色底物：DCHBS与AAP（或DMB），在过氧化物酶/H2O2作用下生成有色产物。
- 反应介质：磷酸钾缓冲液（50 mM，pH 7.5），用于溶液相比色检测。
中文摘要
来自链霉菌 Streptomyces coelicolor A3(2) 的共价黄素蛋白醛糖醇氧化酶 AldO，通过与微过氧化物酶 MP292 融合而获得额外催化功能。该融合蛋白在大肠杆菌周质中表达并纯化后，得到一种合成双功能酶，既完全共价黄素化又完全共价血红素化，被称为氧化过氧化物酶。表征表明，氧化酶与过氧化物酶两种功能均保持活性，且该构建体可作为单组分木糖醇生物传感器。为缩小氧化酶-过氧化物酶融合蛋白尺寸，作者将 AldO 天然序列的部分区段替换为细菌细胞色素 c 的 CXXCH 血红素结合基序；仅突变 AldO 蛋白中的三个残基，即成功构建了具有功能的氧化酶-过氧化物酶杂交酶。该工作首次将氧化酶与过氧化物酶整合到单一蛋白骨架中，展示了人工酶级联催化和新型生物传感器设计潜力。
英文摘要
The covalent flavoprotein alditol oxidase (AldO) from Streptomyces coelicolor A3(2) was endowed with an extra catalytic functionality by fusing it to a microperoxidase. Purification of the construct resulted in the isolation of a synthetic bifunctional enzyme that was both fully covalently flavinylated and heminylated: an oxiperoxidase. Characterization revealed that both oxidase and peroxidase functionalities were active, with the construct functioning as a single-component xylitol biosensor. In an attempt to reduce the size of the oxidase-peroxidase fusion, we replaced portions of the native AldO sequence with the bacterial cytochrome c CXXCH heme-binding motif. By mutating only three residues of the AldO protein we were able to create a functional oxidase-peroxidase hybrid.