组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
亚硝酸根（nitrite, NO2-）；样品基质：磷酸盐缓冲液（PB, pH 6.5）及水样（干扰研究）
检测原理
该传感器采用介导催化机制。工作电极 GCE 在约 -0.75 V 的负电位下向固定化 CHIT-V 提供电子，使壳聚糖骨架上的联吡啶鎓（viologen）被还原；还原态联吡啶鎓通过静电、疏水及氢键等相互作用接近 Cu-NiR 的 T1 Cu 位点，将电子传递给酶。Cu-NiR 催化亚硝酸根发生 1 电子/2 质子还原：NO2- + 2H+ + e- → NO + H2O。氧化态联吡啶鎓返回电极表面再被还原，形成 EC' 催化循环，使催化还原电流随 NO2- 浓度增加而增大。HPU 膜固定酶与介体并限制小分子泄漏，壳聚糖多孔网络有利于底物传质，因此低浓度下电流与浓度呈线性关系。
检测灵敏度
LOD: 40 nM (S/N = 3)；线性范围: 0.04–11 PM（即 μM）；灵敏度: 14.9 nA/PM（即 nA/μM）；R^2 = 0.999
效应效果
传感器对水样中常见阴离子氯酸盐、氯离子、硫酸盐和亚硫酸盐无干扰，但硝酸根干扰较强，其灵敏度为 9.6 nA/μM，相当于亚硝酸响应的 64%，作者归因于 Cu-NiR 的固有特性。批内重现性 RSD 为 2.8%（n=5，1 μM 亚硝酸），批间 RSD 为 6.0%（n=10）。室温空气保存 65 天仍保留 80% 初始活性，优于 PAPS-V 体系的 51 天和 PVA 体系的 24 天；t90% 约 15 s，快于膜基传感器的 3 min 和 PAPS-V 体系的 60 s。线性范围覆盖饮用水标准 2.2 μM，LOD 40 nM 低于标准值。论文未报告实际样品加标回收，作者认为因硝酸根干扰暂不能直接用于真实水样，但可通过双工作电极流动注射系统同时检测亚硝酸和硝酸。
传感器的构成
- 基底电极：玻璃碳电极（GCE），抛光后作为电子换能界面。
- 识别元件：含铜亚硝酸还原酶（Cu-NiR，来自 Rhodopseudomonas sphaeroides forma sp. denitrificans），催化亚硝酸根还原为一氧化氮。
- 介体修饰层：联吡啶鎓修饰壳聚糖（CHIT-V），由 1-(3-氨基丙基)-1'-甲基-4,4'-联吡啶鎓（viologen）经戊二醛和氰基硼氢化钠共价连接壳聚糖（CHIT）骨架，作为可逆氧化还原介体。
- 固定覆盖膜：亲水性聚氨酯（HPU，HydroThane AL-25-80A），滴涂覆盖 Cu-NiR 与 CHIT-V，固定生物元件并控制传质。
- 检测介质：磷酸盐缓冲液（PB，pH 6.5），维持酶活性与离子环境。
- 信号输出：无外加标记物，CHIT-V 介导的酶促催化还原电流作为检测信号。
中文摘要
本文报道了一种基于含铜亚硝酸还原酶（Cu-NiR，来自 Rhodopseudomonas sphaeroides forma sp. denitrificans）与联吡啶鎓修饰壳聚糖（CHIT-V）共固定在玻璃碳电极（GCE）上的电化学亚硝酸生物传感器。可逆氧化还原联吡啶鎓共价连接在壳聚糖骨架上，所得 CHIT-V 与 Cu-NiR 通过滴涂亲水性聚氨酯（HPU）共同固定于 GCE 表面，并介导常规 GCE 与固定化 Cu-NiR 之间的电子转移。电极对亚硝酸的检出限为 40 nM（S/N=3），灵敏度为 14.9 nA/μM，线性范围为 0.04–11 μM（r2=0.999），响应时间 t90% 为 15 s。Lineweaver-Burk 图给出表观 Michaelis-Menten 常数 KMapp 为 65 μM。传感器在室温空气下保存 65 天仍保留 80% 初始活性；对 1 μM 亚硝酸检测的批内相对标准偏差为 2.8%（n=5）。干扰实验表明氯酸盐、氯离子、硫酸盐和亚硫酸盐不干扰，但硝酸根以 64% 的相对灵敏度产生干扰，该效应源于所用 NiR 的固有特性。
英文摘要
An electrochemical nitrite biosensor based on co-immobilization of copper-containing nitrite reductase (Cu-NiR, from Rhodopseudomonas sphaeroides forma sp. denitrificans) and viologen-modified chitosan (CHIT-V) on a glassy carbon electrode (GCE) is presented. Electron transfer (ET) between a conventional GCE and immobilized Cu-NiR was mediated by the co-immobilized CHIT-V. Redox-active viologen was covalently linked to a chitosan backbone, and the thus produced CHIT-V was co-immobilized with Cu-NiR on the GCE surface by drop-coating of hydrophilic polyurethane (HPU). The electrode responded to nitrite with a limit of detection (LOD) of 40 nM (S/N = 3). The sensitivity, linear response range, and response time (t(90%)) were 14.9 nA/μM, 0.04-11 μM (r(2) = 0.999) and 15 s, respectively. The corresponding Lineweaver-Burk plot showed that the apparent Michaelis-Menten constant (K(M) (app)) was 65 μM. Storage stability of the biosensor (retaining 80% of initial activity) was 65 days under ambient air and room temperature storage conditions. Reproducibility of the sensor showed a relative standard deviation (RSD) of 2.8% (n = 5) for detection of 1 μM of nitrite. An interference study showed that anions commonly found in water samples such as chlorate, chloride, sulfate and sulfite did not interfere with the nitrite detection. However, nitrate interfered with a relative sensitivity of 64% and this interference effect was due to the intrinsic character of the NiR employed in this study.