组成图示
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传感器类型
其他（漏表面声波(LSAW)生物传感器）
检测对象
单核苷酸多态性(SNP，日本脑炎病毒Japanese encephalitis virus, JEV A2293G位点)；样品基质：病毒RNA经RT-PCR扩增后的单链DNA/PCR产物
检测原理
捕获探针通过硫醇端固定在LSAW传感器金表面。靶DNA加入后与捕获探针杂交；等位特异性生物素化检测探针再与靶序列杂交。Taq DNA连接酶仅在捕获探针与靶序列完全匹配时，将检测探针连接至杂交链；单碱基错配则不能连接。随后用NaOH变性去除未连接成分，链霉亲和素–辣根过氧化物酶(SA-HRP)通过生物素–链霉亲和素结合连接到连接产物。HRP催化DAB聚合，在传感器表面形成沉淀，使表面质量增加。LSAW对表面质量、黏度和电导变化敏感，质量负载改变边界条件并引起相位角变化。相位角随靶DNA浓度对数增加，从而实现SNP的实时检测。
检测灵敏度
LOD: 1 × 10−12 mol/L；线性范围: 1 × 10−12–1 × 10−6 mol/L；灵敏度方程: ΔP = 1.853lg C + 22.235；r = 0.976
效应效果
在优化条件下，杂交后Target-A与Target-G相位角分别为2.00°±0.24°和2.20°±0.16°，差异不显著；经酶促放大后分别为0.70°±0.08°和15.00°±1.47°，差异显著(p<0.01)，说明系统可区分单碱基错配。杂交步骤CV为12.00%和7.27%，酶促放大步骤CV为11.43%和9.80%，重现性仍有提升空间。对日本脑炎病毒株SA14-14-2和P3的PCR产物检测，相位角分别为3.65°±0.13°和0.56°±0.08°(n=4，p<0.01)，可识别A2293G突变。作者认为该方法无需标记、可实时动态检测，优于不能识别单碱基突变的免疫传感器，但需PCR且周期较长，可用于病原微生物或遗传病诊断。
传感器的构成
- 基底/换能器：36°旋转Y切X传播铌酸锂(LiTaO3)压电单晶，激发漏表面声波(LSAW)并将表面质量/黏度/电导变化转换为相位角变化
- 表面：金表面(Au surface)，提供硫醇自组装固定位点
- 识别元件：5′-SH-(CH2)6-AAACACTTGGTGAACGGCTC-3′捕获探针，经硫醇端固定并与靶DNA杂交
- 识别元件：5′-Phosphate-TTCCTATGGAGTTGAAGACCCC-biotin-3′生物素化等位特异性检测探针，与靶序列杂交后参与连接
- 信号标记物：链霉亲和素–辣根过氧化物酶(SA-HRP)，通过生物素–链霉亲和素结合连接至连接产物
- 信号放大底物：3,3-二氨基联苯胺(DAB)，被HRP催化聚合形成表面沉淀
- 反应介质：PBS缓冲液（Na+ 0.3 mol/L，pH 7.6）及NaOH变性液，维持杂交、连接与变性步骤
中文摘要
本文报道了一种将漏表面声波（LSAW）生物传感器、酶促DNA连接和酶促信号放大相结合的单核苷酸多态性（SNP）检测新方法。该技术中，靶DNA与固定在LSAW生物传感器表面的捕获探针杂交；随后，杂交序列在Taq DNA连接酶作用下与生物素标记的等位特异性检测探针连接。若靶序列与捕获探针之间存在单碱基错配，则连接反应不能发生。连接后的检测探针经生物素–链霉亲和素复合物转化为链霉亲和素–辣根过氧化物酶（SA–HRP）末端基团。SA–HRP催化3,3-二氨基联苯胺（DAB）聚合，在传感器表面形成沉淀，从而有效提高表面质量变化的检测灵敏度，实现SNP检测。最佳检测条件为：PBS中钠离子浓度0.3 mol/L、pH 7.6、捕获探针浓度0.5 μmol/L、靶序列浓度1.0 μmol/L。检出限为1×10−12 mol/L。利用该技术可检测日本脑炎病毒核苷酸A2293G位点的单点突变。
英文摘要
This manuscript describes a new technique for detecting single-nucleotide polymorphisms (SNPs) by integrating a leaky surface acoustic wave (LSAW) biosensor, enzymatic DNA ligation and enzymatic signal amplification. In this technique, the DNA target is hybridized with a capture probe immobilized on the surface of a LSAW biosensor. Then, the hybridized sequence is ligated to biotinylated allele-specific detection probe using Taq DNA ligase. The ligation does not take place if there is a single-nucleotide mismatch between the target and the capture probe. The ligated detection probe is transformed into a streptavidin-horseradish peroxidase (SA-HRP) terminal group via a biotin-streptavidin complex. Then, the SA-HRP group catalyzes the polymerization of 3,3-diaminobenzidine (DAB) to form a surface precipitate, thus effectively increasing the sensitivity of detecting surface mass changes and allowing detection of SNPs. Optimal detection conditions were found to be: 0.3 mol/L sodium ion concentration in PBS, pH 7.6, capture probe concentration 0.5 μmol/L and target sequence concentration 1.0 μmol/L. The detection limit was found to be 1 × 10(-12)mol/L. Using this technique, we were able to detect a single-point mutation at nucleotide A2293G in Japanese encephalitis virus.