组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
内皮细胞凋亡（endothelial cell apoptosis）、caspase-3 激活（caspase-3 activation）；样品基质：HUVEC-C3 活细胞培养物（96孔板/盖玻片细胞培养体系）
检测原理
该传感器以稳定表达 C3 融合蛋白（CFP-DEVD-YFP）的 HUVEC-C3 细胞为全细胞传感平台。正常内皮细胞中，CFP 与 YFP 空间邻近，激发 CFP 后发生 FRET，YFP 绿光增强，Y/C 发射比高。凋亡诱导剂（UV、paclitaxel、dioscin 等）使细胞内 caspase-3 激活，特异性切割 DEVD 位点，导致 CFP 与 YFP 分离，FRET 被破坏，CFP 蓝光增强而 YFP 绿光减弱，Y/C 比下降。荧光酶标仪在 440 nm 激发下分别测量 486 nm CFP 和 535 nm YFP 发射，计算 Y/C 比，从而实时、定量反映 caspase-3 激活和凋亡程度。
检测灵敏度
CC50: paclitaxel FRET 0.71 ± 0.11 nM, MTT 1.20 ± 0.04 nM; vincristine FRET 2.29 ± 0.09 nM, MTT 3.06 ± 0.04 nM; dioscin MTT 2.18 ± 0.56 μM
效应效果
该体系能区分凋亡与坏死：H2O2（5 mM）和 Triton X-100（0.1%）使活力接近0，但Y/C比基本不变（6 h为5.37±0.77和6.28±0.41，对照5.75±0.63）。Z-VAD-FMK（40 μM）显著抑制paclitaxel诱导的Y/C下降，说明依赖caspase-3。Z0为0.66（>0.5）。与MTT相比更敏感：paclitaxel CC50为0.71±0.11 nM（MTT 1.20±0.04 nM），vincristine为2.29±0.09 nM（MTT 3.06±0.04 nM）。dioscin 5、10 μM降低Y/C，10 μM 24 h增加caspase-3活性并诱导PARP切割，CC50为2.18±0.56 μM，具VDA潜力。
传感器的构成
- 培养基底：96-well plate 或 coverslip/Petri dish，承载 HUVEC-C3 细胞并适配酶标仪或荧光显微镜。
- 传感细胞：HUVEC-C3 稳定细胞系，持续表达 C3 FRET 传感器，作为全细胞传感平台。
- 细胞培养介质：DMEM/F12、10% FBS 和 500 μg/mL geneticin，维持细胞存活与传感器稳定表达。
- 荧光供体：CFP（cyan fluorescent protein），接受激发后向 YFP 传递能量，切割后发射蓝光。
- 识别切割位点：DEVD（Asp-Glu-Val-Asp），caspase-3 凋亡激活后的特异性切割序列。
- 荧光受体：YFP（yellow fluorescent protein），接受 CFP 能量后发射绿光，用于计算 Y/C 比。
- 荧光读出：Zeiss Axiovert 100 荧光显微镜或 Perkin-Elmer Victor3 酶标仪，测量 CFP/YFP 发射强度。
中文摘要
本研究建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的高通量内皮细胞凋亡检测方法。作者将 caspase-3 特异性 FRET 生物传感器 C3（CFP-DEVD-YFP）稳定转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），构建 HUVEC-C3 细胞系。正常状态下 CFP 激发后能量转移至 YFP，细胞呈绿色荧光；当紫外线或紫杉醇等凋亡诱导剂激活 caspase-3 并切割 DEVD 位点时，FRET 消失，荧光由绿转蓝。该方法在 96 孔板中通过测量 YFP/CFP 发射比实现高通量、实时监测，Z0 因子大于 0.5，表明适合高通量筛选。作者进一步用该体系筛选血管破坏剂（VDA），从内部化合物库中鉴定出 dioscin 为活性化合物。该检测可用于活细胞内皮凋亡监测和新 VDA 候选物发现。
英文摘要
In this study, we developed a high-throughput endothelial cell apoptosis assay using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensor. After exposure to apoptotic inducer UV-irradiation or anticancer drugs such as paclitaxel, the fluorescence of the cells changed from green to blue. We developed this method into a high-throughput assay in 96-well plates by measuring the emission ratio of yellow fluorescent protein (YFP) to cyan fluorescent protein (CFP) to monitor the activation of a key protease, caspase-3, during apoptosis. The Z' factor for this assay was above 0.5 which indicates that this assay is suitable for a high-throughput analysis. Finally, we applied this functional high-throughput assay for screening vascular disrupting agents (VDA) which could induce endothelial cell apoptosis from our in-house compounds library and dioscin was identified as a hit. As this assay allows real time and sensitive detection of cell apoptosis, it will be a useful tool for monitoring endothelial cell apoptosis in living cell situation and for identifying new VDA candidates via a high-throughput screening.