组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
特定靶DNA（HIV相关DNA序列，target DNA）；样品基质：缓冲液/溶液（10 mM Tris–HCl，pH 7.4）
检测原理
P1探针通过巯基自组装于金电极并形成茎环结构，其3′突出端可抵抗ExoIII。靶DNA加入后与P1杂交形成双链区，ExoIII从P1的3′-羟基端逐步切除单核苷酸，直至双链区被消耗；靶DNA随后解离并继续与另一条完整P1杂交，循环触发多条P1消化，实现第一级放大。消化后的P1由茎环变为线性结构，暴露与P2互补的序列，并与P2功能化的Au NPs杂交，使大量Au NPs固定于电极，实现第二级放大。[Ru(NH3)6]3+静电结合DNA骨架，其氧化还原峰电流或计时库仑电荷密度随靶DNA浓度增加而增大，从而完成电化学读出。
检测灵敏度
LOD: 33 pM (3 times signal-to-noise ratio)；线性范围: 100 pM–10 nM；回归方程: ΔCharge (10−6 C) = 0.12062 + 0.02891x (10−9 M)；R = 0.997
效应效果
该传感器表现出高选择性和良好重现性。在1 μM非互补对照DNA存在下，表面电荷密度几乎无变化；而100 nM靶DNA即可引起显著信号增加，说明非互补序列不能启动放大反应。三次重复测量的相对标准偏差均在10%以内。计时库仑法检出限为33 pM，低于此前外切酶电化学检测的10 nM，并与荧光法和比色法相当。方法在37 ℃恒温下进行，避免PCR复杂温度循环；ExoIII不依赖特定识别序列，靶序列选择灵活，作者认为其可用于临床诊断、突变检测和生物防御等DNA检测场景。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：5 mm 金电极（Au electrode），经抛光、超声和电化学清洗，提供传感界面与电子转导基底。
- 识别元件：巯基修饰探针DNA P1（5′-SH-...-3′），自组装于金表面形成茎环结构，含ExoIII抗性3′突出端，用于识别靶DNA。
- 封闭剂：巯基己醇（MCH, mercaptohexanol），处理P1修饰电极以封闭非特异性位点。
- 信号放大酶：外切酶III（ExoIII），识别P1-靶DNA双链区并从3′-OH端逐步消化P1，实现靶DNA循环放大。
- 纳米材料修饰层：13 nm 金纳米颗粒（Au NPs），柠檬酸法制备，作为DNA载体与电化学信号放大平台。
- 识别元件：巯基修饰探针DNA P2（5′-SH-...-3′），功能化于Au NPs表面，与消化后P1暴露序列杂交，将Au NPs固定到电极。
- 信号标记物：六氨合钌(III)（[Ru(NH3)6]3+），静电结合DNA骨架，提供循环伏安/计时库仑电化学信号。
- 检测介质：10 mM Tris–HCl（pH 7.4）含50 μM [Ru(NH3)6]3+；EIS用0.1 M PBS/KCl含[Fe(CN)6]3−/4−。
中文摘要
本文报道了一种基于外切酶III（ExoIII）和探针DNA功能化金纳米颗粒（Au NPs）的电化学生物传感器，用于高灵敏、高特异性检测特定DNA序列。探针DNA P1通过巯基自组装于金电极表面，可自杂交形成带有ExoIII抗性3′突出端的茎环结构；当存在靶DNA时，P1与靶DNA杂交形成双链区，ExoIII从3′-羟基端逐步消化P1直至双链区被消耗。单个靶DNA可循环触发多条P1的消化，实现第一级信号放大。消化后的P1暴露出与探针P2互补的序列，并与预先修饰在Au NPs表面的P2杂交，使大量负载DNA的Au NPs固定到电极表面。随后，大量电化学活性分子六氨合钌(III)（[Ru(NH3)6]3+）静电结合DNA，产生强电化学响应，实现第二级信号放大。循环伏安法和计时库仑法研究表明，该传感器可在皮摩尔水平检测靶DNA，并具有良好的特异性。
英文摘要
Herein we report a sensitive electrochemical biosensor for DNA detection by making use of exonuclease III and probe DNA functionalized gold nanoparticles. While probe DNA P1 modified on a gold electrode surface can self-hybridize into a stem-loop structure with an exonuclease III-resistant 3' overhang end, in the presence of target DNA, P1 may also hybridize with the target DNA to form a duplex region. Therefore, exonuclease III may selectively digest P1 from its 3'-hydroxyl termini until the duplex is fully consumed. Since a single target DNA can trigger exonuclease III digestion of numerous P1 strands, the first signal amplification is achieved. On the other hand, since the digested P1, exposing its complementary sequence to probe DNA P2, can further hybridize with P2 that has been previously modified on the surface of gold nanoparticles, many nanoparticles loaded with numerous DNA strands are immobilized onto the electrode surface. Consequently, large amount of electroactive molecules [Ru(NH(3))(6)](3+) can bind with the DNA strands to produce an intense electrochemical response as the second signal amplification. Based on the studies with cyclic voltammetry (CV) and chronocoulometry (CC) techniques, the proposed biosensor can sensitively detect specific target DNA at a picomolar level with high specificity.