组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
RhoA 活性（active RhoA / RhoA-GTP）；样品基质：16HBE 人支气管上皮活细胞内
检测原理
该工具以单链 RhoA FRET 生物传感器在活细胞内报告 RhoA 活性。传感器由 CFP 供体、YFP 受体和 RhoA 活性结合/调控域组成。当 RhoA 处于 GTP 结合活性状态时，传感器构象改变，使 CFP 与 YFP 的距离或取向更接近 FRET 有效范围，能量转移效率升高，表现为 FRET/CFP 发射比值增加；当 RhoA 处于 GDP 非活性状态时，FRET 信号较低。因此，局部 RhoA 活性升高会使 FRET/CFP 比值升高，活性降低则比值下降。文中在新生细胞-细胞接触区进行共聚焦比值成像，Myosin-IXA 缺失使该区域 RhoA 活性升高，FRET/CFP 比值较对照升高约2倍。该过程无外源酶促或核酸放大，主要依赖 FRET 比值成像实现空间分辨读出。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
文中未将该 FRET 工具作为商品化传感器进行选择性、抗干扰、稳定性或回收率评价，但提供了生物学验证数据。在 Myosin-IXA 敲低的 16HBE 细胞中，新生细胞-细胞接触处 FRET/CFP 比值较对照升高约2倍，共分析14个细胞-细胞接触，三次独立实验，p=0.008。Western blot 显示 MLC 磷酸化水平较对照增加10%，G-LISA 显示总细胞 RhoGTP 水平增加25%；表达含 RhoGAP 的 EGFP-tail 使 Rho 活性较 EGFP-motor-neck 降低37%。这些结果支持该 FRET 比值成像可空间分辨地反映新生连接处 RhoA 活性变化，并用于揭示 Myosin-IXA 作为局部 Rho 负调控因子维持上皮集体迁移的作用。
传感器的构成
- 报告分子：单链 RhoA FRET 生物传感器，用于在活细胞内报告 RhoA GTP 结合活性
- 荧光供体：CFP（cyan fluorescent protein），作为 FRET 供体
- 荧光受体：YFP（yellow fluorescent protein），作为 FRET 受体
- 识别/调控元件：RhoA 活性结合/调控域（原文未给出具体序列），感知 RhoA-GTP 状态
- 样品基质：16HBE 人支气管上皮活细胞内
- 读出装置：共聚焦显微镜，采集 FRET/CFP 比值图像
中文摘要
上皮组织在形态发生、修复和更新过程中发生广泛的集体运动。上皮细胞集体迁移需要细胞间协调细胞-细胞黏附并建立前后极性，同时维持顶底极性，但其分子机制尚不清楚。作者利用 RNA 干扰筛选鉴定人支气管上皮细胞集体迁移所需的 Rho 家族 GTP 酶调节因子，发现肌球蛋白-IXA（Myo9a）。在集体迁移细胞中敲低兼具 RhoGAP 和肌动蛋白马达功能的 Myosin-IXA，导致肌动蛋白骨架组织改变、依赖张力的细胞-细胞黏附破坏，并因无法形成新黏附而发生细胞分散。进一步观察表明，Myosin-IXA 在细胞接触后不久形成连接相关肌动蛋白束时是必需的。结构-功能分析显示，马达结构域对结合肌动蛋白丝是必要且充分的，而表达 RhoGAP 结构域可部分挽救 Myosin-IXA 敲低引起的细胞分散表型。最后，荧光共振能量转移生物传感器显示，与对照相比，Myosin-IXA 缺失细胞在新生细胞-细胞接触处的 Rho 活性显著升高。作者提出，Myosin-IXA 局部调控 Rho 及新生细胞-细胞黏附相关细肌动蛋白束的组装，这对维持上皮细胞集体迁移是必需的。
英文摘要
BACKGROUND: Epithelial tissues undergo extensive collective movements during morphogenesis, repair, and renewal. Collective epithelial cell migration requires the intercellular coordination of cell-cell adhesions and the establishment of anterior-posterior polarity, while maintaining apical-basal polarity, but how this is achieved at the molecular level is not well understood.
RESULTS: Using an RNA interference-based screen to identify Rho family GTPase regulators required for the collective migration of human bronchial epithelial cells, we identified myosin-IXA (gene name: Myo9a). Depletion of myosin-IXA, a RhoGAP and actin motor protein, in collectively migrating cells led to altered organization of the actin cytoskeleton and tension-dependent disruption of cell-cell adhesions, followed by an inability to form new adhesions resulting in cell scattering. Closer examination revealed that myosin-IXA is required during the formation of junction-associated actin bundles soon after cell-cell contact. Structure-function analysis of myosin-IXA revealed that the motor domain is necessary and sufficient for binding to actin filaments, whereas expression of the RhoGAP domain partially rescued the cell scattering phenotype induced by myosin-IXA depletion. Finally, a fluorescence resonance energy transfer biosensor revealed a significant increase in Rho activity at nascent cell-cell contacts in myosin-IXA depleted cells compared to controls.
CONCLUSION: We propose that myosin-IXA locally regulates Rho and the assembly of thin actin bundles associated with nascent cell-cell adhesions and that this is required to sustain the collective migration of epithelial cells.