组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
淋病奈瑟菌特异性DNA（Neisseria gonorrhoeae DNA，Opa基因靶序列）；样品基质：细菌培养物、脓液加标样本、男性患者临床样本及PCR阳性/阴性扩增子
检测原理
传感器以 ITO 为导电基底，PANI–nFe3O4–CNT 纳米复合膜提供高导电性和大电活性面积。生物素化 20 碱基探针通过亲和素固定在电极表面，用于识别淋病奈瑟菌 Opa 基因靶 DNA。当靶 DNA 存在时，探针与靶序列杂交形成双链 DNA。亚甲基蓝（MB）作为电活性指示剂，优先与单链 DNA 中的鸟嘌呤碱基结合，在差分脉冲伏安法（DPV）中产生特征峰电流；杂交后双螺旋结构产生空间位阻，抑制 MB 与 DNA 的结合/嵌入，使 MB 峰电流下降。靶 DNA 浓度越高，表面杂交程度越高，MB 峰电流变化越大。PANI、nFe3O4 和 CNT 协同改善电子转移动力学，使信号在 1×10−19 M 至 1×10−6 M 范围内与靶 DNA 对数浓度呈线性关系。
检测灵敏度
LOD: 1×10−19 M；线性范围: 1×10−19 M–1×10−6 M；回归系数: 0.9975；斜率: 3.2 μA/log M（Current(μA)=3.2 log[compDNA]+13.7）
效应效果
该传感器对单碱基错配和非互补 DNA 无明显杂交响应，序列特异性良好。4 个淋病阳性 PCR 扩增子使 MB 峰高显著下降，4 个阴性扩增子变化可忽略。培养分离样本、脓液加标样本和男性患者样本均出现 DPV 信号显著下降，但因样本细菌 DNA 载量差异未给出定量回收率。传感器经 0.5 M NaOH 浸泡 30 s 可再生，至少重复使用 15 次，稳定性约 150 天；实验重复至少 15 次，但未报告 RSD。与文献 N. gonorrhoeae 传感器相比，LOD 1×10−19 M 低于 0.14×10−15 M、1×10−18 M、1×10−16 M 等报道值。作者认为该平台有望用于开发手持检测设备，并有助于降低 HIV 传播风险。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：ITO 玻璃板（indium tin oxide, ITO），导电基底，经 H2O2/NH4OH/H2O 处理引入羟基
- 纳米复合材料修饰层：PANI–nFe3O4–CNT 纳米复合膜（polyaniline, PANI；iron oxide nanoparticles, nFe3O4；multiwalled carbon nanotubes, CNT），由苯胺电化学聚合沉积，提供导电通道、增大电活性面积并稳定纳米颗粒
- 识别元件固定层：活化亲和素（avidin, Avi），经 EDC/NHS 活化后固定于复合膜，用于生物素–亲和素偶联
- 识别元件：生物素化 20 碱基寡核苷酸探针（biotinylated DNA, BDNA），序列 5′-CCGGTGCTTCATCACCTTAG-3′，识别 N. gonorrhoeae Opa 基因靶 DNA
- 信号指示剂：亚甲基蓝（methylene blue, MB），电活性指示剂，与单链 DNA 鸟嘌呤结合产生 DPV 峰
- 检测介质：0.05 M PBS（pH 7.0，0.9% NaCl）含 20 μM MB，用于差分脉冲伏安法（DPV）测量
中文摘要
本文报道了一种基于聚苯胺（PANI）–氧化铁纳米颗粒（nFe3O4）–多壁碳纳米管（CNT）纳米复合材料的电化学基因传感器。该纳米复合膜通过简便的电化学聚合方法沉积在氧化铟锡（ITO）玻璃电极上，其中 nFe3O4 粒径约 20 nm，CNT 直径 20–80 nm。透射电镜结果表明 PANI 和 nFe3O4 包覆在 CNT 表面，PANI 链可稳定 nFe3O4 并减少团聚。所得 PANI–nFe3O4–CNT/ITO 纳米电极经傅里叶变换红外光谱、X 射线衍射和扫描电镜表征。随后，20 碱基生物素化核酸探针通过生物素–亲和素偶联固定在电极表面。该传感器利用亚甲基蓝作为电活性指示剂，采用差分脉冲伏安法检测淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）特异性 DNA，可在 298 K、45 s 杂交时间内检出低至 1×10−19 M 的靶序列，表现出高灵敏度。作者还测试了 4 个阳性和 4 个阴性淋病患者 PCR 扩增子，结果表明该传感器具有良好特异性，并有望用于开发淋病奈瑟菌检测的手持设备，从而有助于降低 HIV 传播风险。
英文摘要
The nanocomposite based on polyaniline (PANI)-iron oxide nanoparticles (nFe(3)O(4)) and multi walled carbon-nanotubes (CNT) has been fabricated onto indium tin oxide (ITO) coated glass plate via facile electrochemical synthesis of polyaniline in presence of nFe(3)O(4) (~20 nm) and CNT (20-80 nm in diameter). The results of transmission electron microscopic studies show evidence of coating of PANI and nFe(3)O(4) onto the CNT. The PANI-nFe(3)O(4)-CNT/ITO nanoelectrode has been characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction and scanning electron microscopy studies. The biotinylated nucleic acid probe sequence consisting of 20 bases has been immobilized onto PANI-nFe(3)O(4)-CNT/ITO nanoelectrode using biotin-avidin coupling. It is shown that the PANI-nFe(3)O(4)-CNT platform based biosensor can be used to specifically detect bacteria (N. gonorrhoeae) at minute concentration as low as (1×10(-19) M) indicating high sensitivity within 45 s of hybridization time at 298 K by differential pulse voltammetry using methylene blue as electroactive indicator. This bacterial sensor has also been tested with 4 positive and 4 negative PCR amplicons of gonorrhoea affected patient samples. The results of these studies have implications towards the fabrication of a handheld device for Neisseria gonorrhoeae detection that may perhaps result in a decrease in the human immunodeficiency virus infections.