组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
L1PA2逆转录元件5′-UTR DNA可及性/甲基化状态（L1PA2 retroelement 5′-UTR DNA accessibility/methylation status）；样品基质：HeLa活细胞及细胞裂解液
检测原理
该传感器为基因编码的DNA引导纳米组装（DGnA）系统。两个独立模块分别由多指锌指（PZF）ZF1/ZF2、半VMA intein（NInt/CInt）和半荧光素酶（NLuc/CLuc）融合而成，并带His和NLS标签。当L1PA2 5′-UTR因去甲基化而染色质开放、DNA可及性增加时，ZF1和ZF2分别结合相邻的15 bp靶序列，使两个模块在空间上靠近。随后条件蛋白拼接由intein催化，将NLuc与CLuc共价连接，形成有活性的荧光素酶。加入荧光素（luciferin）后，荧光素酶催化底物氧化并发出光子，经luminometer读出。可及L1PA2位点越多或药物诱导去甲基化越强，拼接形成的活性酶越多，发光信号越强；无靶结合时存在非条件intein拼接本底。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
ELISA显示ZF1和ZF2特异性结合各自L1PA2野生型靶序列，最强信号对应Tg1wt和Tg2wt，突变序列结合弱。HeLa细胞中两模块表达量约56,000–134,000个/细胞；共转染不同量靶DNA后，萤火虫/海肾荧光素酶比值随靶DNA增加而升高，空载体存在非条件intein拼接本底。2.5 mM decitabine处理4或5天后，21个CpG中8个甲基化降至对照70%以下，最低相对甲基化为51%、54%和55%。递增剂量decitabine和5-azacytidine处理均使发光呈剂量依赖性增加，实验为三重复并报告标准误。作者认为可用于活细胞表观遗传成像和药物筛选，但信噪比尚不足以检测单拷贝位点。
传感器的构成
- 细胞基质/表达载体：DNA4/HisMax哺乳动物表达质粒与HeLa细胞，用于转染表达两个传感器模块
- 识别元件：多指锌指蛋白ZF1和ZF2（PZF），分别识别L1PA2 5′-UTR相邻15 bp靶序列
- 条件拼接元件：分裂VMA intein半段NInt和CInt，在靶DNA结合后催化蛋白拼接
- 换能/报告酶：分裂荧光素酶半段NLuc和CLuc（firefly luciferase），拼接后形成活性荧光素酶
- 定位/检测标签：N端His标签和NLS标签，用于蛋白检测与核定位
- 信号底物：荧光素（luciferin），被活性荧光素酶催化氧化产生化学发光
- 转染对照：海肾荧光素酶质粒pRL-TK（Renilla luciferase），用于双荧光素酶比值归一化
中文摘要
去甲基化药物可诱导癌细胞中异常沉默的抑癌基因去甲基化并重新激活，但也可能导致重复元件甲基化丢失等潜在有害效应。为观察与重复DNA去甲基化相关的药物不良效应，作者开发了一种可在活细胞中通过发光报告DNA可及性变化的新型生物传感器。该传感器由两个独立模块组成，每个模块均包含多指锌指结构域、半intein结构域和分裂荧光素酶结构域；当两个模块分别结合相邻DNA靶位点后，可通过条件蛋白拼接连接并恢复荧光素酶活性。作者设计的人工锌指蛋白特异性靶向Line-1逆转录元件L1PA2亚家族启动子区附近的DNA序列，可在经decitabine或5-azacytidine处理的人细胞中产生发光信号，从而报告逆转录元件表观遗传沉默丧失和DNA可及性增加。
英文摘要
Treatment with demethylating drugs can induce demethylation and reactivation of abnormally silenced tumor suppressor genes in cancer cells, but it can also induce potentially deleterious loss of methylation of repetitive elements. To enable the observation of unwanted drug effects related to loss of methylation of repetitive DNA, we have developed a novel biosensor capable of reporting changes in DNA accessibility via luminescence, in living cells. The biosensor design comprises two independent modules, each with a polydactyl zinc finger domain fused to a half intein and to a split-luciferase domain that can be joined by conditional protein splicing after binding to adjacent DNA targets. We show that an artificial zinc finger design specifically targeting DNA sequences near the promoter region of the L1PA2 subfamily of Line-1 retroelements is able to generate luminescent signals, reporting loss of epigenetic silencing and increased DNA accessibility of retroelements in human cells treated with the demethylating drugs decitabine or 5-azacytidine.